抗結(jié)腸癌功能益生菌篩選及其誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)腸癌是威脅人類健康和生命的惡性疾病，其發(fā)病率和死亡率均很高。導(dǎo)致人結(jié)腸癌發(fā)病的原因很多，其中最重要的誘發(fā)因素是飲食。資料表明高脂肪、高蛋白和低纖維的飲食導(dǎo)致人結(jié)腸癌的發(fā)病率上升，而攝入益生菌對(duì)結(jié)腸癌有預(yù)防和抑制作用。但是，對(duì)于益生菌抑制結(jié)腸腫瘤的生長(zhǎng)作用機(jī)理尚不十分清楚。
　　本論文以本實(shí)驗(yàn)室人員先前從中國(guó)西部地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品及嬰兒、成人糞便中分離出的138株益生菌為供試菌株，以標(biāo)準(zhǔn)菌株 Lactobacillus rhamno

2、sus GG（ATCC43121，USA）為陽(yáng)性對(duì)照，采用MTT實(shí)驗(yàn)法初步篩選出活菌體具有顯著抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖能力的益生菌11株。又基于益生功能（包括黏附于腸上皮細(xì)胞能力、耐受模擬胃液和模擬腸液能力）對(duì)11株益生菌進(jìn)行篩選，獲得4株益生菌（M5、X11、X12和K14），其黏附能力、耐酸能力和耐膽鹽能力顯著高于陽(yáng)性對(duì)照 LGG（P<0.05）。經(jīng)16S rDNA種屬鑒定，M5和X12屬于副干酪乳桿菌，X11和K14屬于干酪乳

3、桿菌。
　　進(jìn)一步對(duì)菌株M5、X11、X12和K14細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)成分進(jìn)行抗結(jié)腸癌能力篩選，同樣以LGG菌株為陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)篩選出菌株M5、X11、X12、K14菌體細(xì)胞壁和M5、K14菌體細(xì)胞質(zhì)具有顯著抑制HT-29細(xì)胞增殖的能力（P<0.05）。繼續(xù)對(duì)菌體成分進(jìn)行誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡能力實(shí)驗(yàn)，采用SCGE實(shí)驗(yàn)、DNA ladder實(shí)驗(yàn)、Annexin-V與PI染色、細(xì)胞周期分析、細(xì)胞膜電勢(shì)檢測(cè)、透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

4、等凋亡指標(biāo)進(jìn)行篩選，最終獲得菌株X12、M5和K14的細(xì)胞壁能顯著誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞DNA損傷和凋亡（P<0.05），而其對(duì)正常細(xì)胞（Vero）毒性作用很小，顯著低于結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞（P<0.05）。
　　以菌株X12、M5和K14細(xì)胞壁肽聚糖為研究目標(biāo)，檢測(cè)其抑制HT-29細(xì)胞增殖的能力。以5-Fu為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)MTT和TBE實(shí)驗(yàn)確定菌株X12和M5肽聚糖具有抑制HT-29細(xì)胞增殖的能力（P<0.05）。SDS-PAGE分

5、析證實(shí)了X12和M5肽聚糖的存在，其分子量均約為14.4 kDa。通過(guò)對(duì)X12和M5肽聚糖氨基酸組分分析發(fā)現(xiàn)，其基本氨基酸組成為丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸和賴氨酸。電鏡觀察顯示X12和M5細(xì)胞壁肽聚糖保留了原菌體細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)Annexin-V與PI染色分析和細(xì)胞周期分析，確定了X12和M5細(xì)胞壁肽聚糖可誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡。
　　最后，對(duì)X12和M5肽聚糖誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡途徑進(jìn)行研究。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，肽聚糖降低

6、了HT-29細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)（?m），并誘導(dǎo)胞內(nèi)活性氧（ROS）的堆積。相對(duì)于陰性對(duì)照組，80μg/mL和160μg/mL的M5肽聚糖組△?m分別下降了13.63％和16.23%；而80μg/mL和160μg/mL的X12肽聚糖組則分別下降了27.79%和30.60%。M5肽聚糖誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS堆積的最佳劑量為160μg/mL，比陰性對(duì)照高了42.10%；而X12肽聚糖誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS堆積的最佳劑量是320μg/mL，比陰性對(duì)照高了近66.

7、71%。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，X12和M5肽聚糖均促進(jìn)了HT-29細(xì)胞色素C（Cyto-C）從線粒體釋放到胞漿中。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，X12和M5肽聚糖上調(diào)HT-29細(xì)胞促凋亡基因Bax和Bad的mRNA表達(dá)，下調(diào)抗凋亡基因Bcl-xl的mRNA表達(dá)，并激活了Caspase-3，而且其誘導(dǎo)作用在本研究劑量范圍內(nèi)呈劑量依賴性關(guān)系。另外，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，X12肽聚糖上調(diào)了HT-29細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)了B