抗結(jié)腸癌功能益生菌篩選及其誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡機制研究.pdf

1、結(jié)腸癌是威脅人類健康和生命的惡性疾病，其發(fā)病率和死亡率均很高。導(dǎo)致人結(jié)腸癌發(fā)病的原因很多，其中最重要的誘發(fā)因素是飲食。資料表明高脂肪、高蛋白和低纖維的飲食導(dǎo)致人結(jié)腸癌的發(fā)病率上升，而攝入益生菌對結(jié)腸癌有預(yù)防和抑制作用。但是，對于益生菌抑制結(jié)腸腫瘤的生長作用機理尚不十分清楚。
　　本論文以本實驗室人員先前從中國西部地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品及嬰兒、成人糞便中分離出的138株益生菌為供試菌株，以標(biāo)準(zhǔn)菌株 Lactobacillus rhamno

2、sus GG（ATCC43121，USA）為陽性對照，采用MTT實驗法初步篩選出活菌體具有顯著抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖能力的益生菌11株。又基于益生功能（包括黏附于腸上皮細(xì)胞能力、耐受模擬胃液和模擬腸液能力）對11株益生菌進行篩選，獲得4株益生菌（M5、X11、X12和K14），其黏附能力、耐酸能力和耐膽鹽能力顯著高于陽性對照 LGG（P<0.05）。經(jīng)16S rDNA種屬鑒定，M5和X12屬于副干酪乳桿菌，X11和K14屬于干酪乳

3、桿菌。
　　進一步對菌株M5、X11、X12和K14細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)成分進行抗結(jié)腸癌能力篩選，同樣以LGG菌株為陽性對照。通過MTT實驗篩選出菌株M5、X11、X12、K14菌體細(xì)胞壁和M5、K14菌體細(xì)胞質(zhì)具有顯著抑制HT-29細(xì)胞增殖的能力（P<0.05）。繼續(xù)對菌體成分進行誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡能力實驗，采用SCGE實驗、DNA ladder實驗、Annexin-V與PI染色、細(xì)胞周期分析、細(xì)胞膜電勢檢測、透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

4、等凋亡指標(biāo)進行篩選，最終獲得菌株X12、M5和K14的細(xì)胞壁能顯著誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞DNA損傷和凋亡（P<0.05），而其對正常細(xì)胞（Vero）毒性作用很小，顯著低于結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞（P<0.05）。
　　以菌株X12、M5和K14細(xì)胞壁肽聚糖為研究目標(biāo)，檢測其抑制HT-29細(xì)胞增殖的能力。以5-Fu為陽性對照，通過MTT和TBE實驗確定菌株X12和M5肽聚糖具有抑制HT-29細(xì)胞增殖的能力（P<0.05）。SDS-PAGE分

5、析證實了X12和M5肽聚糖的存在，其分子量均約為14.4 kDa。通過對X12和M5肽聚糖氨基酸組分分析發(fā)現(xiàn)，其基本氨基酸組成為丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸和賴氨酸。電鏡觀察顯示X12和M5細(xì)胞壁肽聚糖保留了原菌體細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)。經(jīng)過Annexin-V與PI染色分析和細(xì)胞周期分析，確定了X12和M5細(xì)胞壁肽聚糖可誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡。
　　最后，對X12和M5肽聚糖誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡途徑進行研究。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，肽聚糖降低

6、了HT-29細(xì)胞線粒體膜電勢（?m），并誘導(dǎo)胞內(nèi)活性氧（ROS）的堆積。相對于陰性對照組，80μg/mL和160μg/mL的M5肽聚糖組△?m分別下降了13.63％和16.23%；而80μg/mL和160μg/mL的X12肽聚糖組則分別下降了27.79%和30.60%。M5肽聚糖誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS堆積的最佳劑量為160μg/mL，比陰性對照高了42.10%；而X12肽聚糖誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS堆積的最佳劑量是320μg/mL，比陰性對照高了近66.

7、71%。ELISA實驗結(jié)果顯示，X12和M5肽聚糖均促進了HT-29細(xì)胞色素C（Cyto-C）從線粒體釋放到胞漿中。RT-PCR實驗結(jié)果顯示，X12和M5肽聚糖上調(diào)HT-29細(xì)胞促凋亡基因Bax和Bad的mRNA表達，下調(diào)抗凋亡基因Bcl-xl的mRNA表達，并激活了Caspase-3，而且其誘導(dǎo)作用在本研究劑量范圍內(nèi)呈劑量依賴性關(guān)系。另外，Western blot實驗結(jié)果也顯示，X12肽聚糖上調(diào)了HT-29細(xì)胞Bax蛋白表達，下調(diào)了B