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文檔簡介
1、目的:本實驗通過建立裸鼠結腸癌肝轉移模型,研究在上調Twist基因表達后對HT-29結腸癌細胞侵襲轉移能力的影響,探究Twist基因和上皮-間質轉化機制的相關標志物N-cadherin、Vimentin和E-cadherin在上皮-間質轉化現象中的表達及其與結腸癌進展、轉移之間的關聯。
方法:使用重組質粒pTracer-CMV/BSD-Twist和陰性對照質粒pTracer-CMV/BSD轉染并經殺稻瘟菌素(Blasticid
2、in)篩選得到穩(wěn)定轉染的人HT-29結腸癌細胞系。采用脾臟原位注射法建立裸鼠結腸癌肝轉移模型,實驗共分為三組:實驗組(轉染上調Twist表達質粒組)、陰性對照組(轉染空質粒組)、空白對照組(未轉染組)。注射30天后獲取各組裸鼠肝臟和脾臟標本,應用熒光實時定量PCR,Western blot和免疫組織化學染色法檢測裸鼠腫瘤組織的Twist和EMT相關分子標志物N-cadherin,Vimentin和E-cadherin的mRNA和蛋白表達
3、情況,并分析各指標的變化。
結果:1.成功建立裸鼠異種結腸癌肝轉移模型,病理檢查結果符合結腸癌肝轉移特點。實驗組脾臟原位腫瘤較陰性對照組及空白對照組大小相近,肝臟轉移腫瘤轉移灶數目多于陰性對照及空白對照組,腫瘤大小未見明顯差異。2.實驗組與陰性對照和空白對照組相比,腫瘤組織的Twist,N-cadherin和Vimentin分子的mRNA轉錄水平(9.9082±0.9137,2.431±0.1636,3.0310±0.2026
4、)和蛋白表達水平(0.9916±0.0508,0.9417±0.1025,0.7231±0.0218)明顯升高(P<0.05);E-cadherin mRNA轉錄水平和蛋白表達水平顯著降低(0.4531±0.0536,0.71±0.0613),差異具有統計學意義(P<0.05)。陰性對照組與空白對照組相比,Twist、N-cadherin、Vimentin和E-cadherin分子的mRNA轉錄水平和蛋白表達水平均無顯著差異(P>0.0
5、5)。3.Twist基因mRNA表達水平在肝臟轉移瘤組織較脾臟原位種植瘤組織中表達升高(P<0.05),差異具有統計學意義。4.免疫組織化學染色結果顯示實驗組肝、脾臟腫瘤細胞Twist,N-cadherin和Vimentin染色陽性細胞數多于陰性對照及空白對照組(P<0.05),E-cadherin染色結果顯示實驗組肝、脾臟腫瘤細胞E-cadherin染色少于陰性對照及空白對照組(P<0.05)。
結論:1.本研究成功建立裸鼠
6、結腸癌肝轉移模型,其操作安全、成瘤率較高,對結腸癌肝轉移的基礎與臨床研究均具有應用價值。
2.在穩(wěn)定轉染高表達Twist基因質粒的HT-29結腸癌細胞株,通過體內實驗,可增強間充質標記物N-cadherin,Vimentin mRNA及蛋白的表達水平,降低上皮標志物E-cadherin mRNA及蛋白的表達水平,促進上皮-間充質轉化,逆轉間質-上皮轉化。
3.在體內實驗中肝臟轉移灶腫瘤的Twist基因mRNA轉錄水平
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