OPN反義寡核苷酸對(duì)微缺氧下人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29體外侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響.pdf

1、術(shù)后肝轉(zhuǎn)移是影響大腸癌原發(fā)灶根治性切除術(shù)后5年生存率的主要原因，如能在術(shù)前或術(shù)中用一簡便易行的指標(biāo)篩選出肝轉(zhuǎn)移的高危病例，采取積極措施加以干預(yù)和控制，這對(duì)提高結(jié)直腸癌患者的生存率具有重要意義。 局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特性，在實(shí)體腫瘤的惡性演進(jìn)中，細(xì)胞外間質(zhì)的微環(huán)境起著重要的調(diào)控作用。缺氧乃實(shí)體腫瘤物理微環(huán)境的基本特征。適度缺氧可能是腫瘤細(xì)胞發(fā)生遺傳不穩(wěn)定，惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的始動(dòng)因素。骨橋蛋白(osteopon

2、tin,OPN)是一種與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的磷酸化糖蛋白，在缺氧下特異性地表達(dá)上調(diào)。但OPN缺乏缺氧反應(yīng)元件(hypoxia response elements，HRE)，并不受HIF-1α的調(diào)控。因此，我們推測OPN可能是繼HIF-1α之外，缺氧下腫瘤生物學(xué)行為的重要調(diào)控點(diǎn)。 結(jié)直腸癌作為消化系統(tǒng)常見的實(shí)體腫瘤，其發(fā)展演進(jìn)同樣也在缺氧的微環(huán)境中進(jìn)行。但就缺氧下結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為而言，尚缺乏較為完整的研究。模擬體內(nèi)的缺氧環(huán)

3、境，深入探討OPN與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系更未見報(bào)道。 我們將腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記物OPN結(jié)合原發(fā)癌灶侵襲前沿的形態(tài)學(xué)特征，探討其與大腸癌肝轉(zhuǎn)移的關(guān)系。將人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29作為研究對(duì)象，參照體內(nèi)腫瘤組織氧分壓水平，建立離體缺氧模型，觀察缺氧下細(xì)胞的生物學(xué)行為，探討OPN與微缺氧誘導(dǎo)的腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)系。第一部分OPN在大腸癌原發(fā)癌灶侵襲邊緣的表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移的關(guān)系目的：本研究旨在探討瘤芽在不同大腸癌病例的分布特征以及OPN等在原發(fā)

4、癌灶和瘤芽的表達(dá)，以評(píng)價(jià)其可否作為Dukes C期大腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素。 方法：將Dukes C期以上病例分成3組：A組為同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移組，B組為異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移組，C組為無肝轉(zhuǎn)移組。HE染色后，重點(diǎn)觀察位于大腸癌侵襲前沿的瘤芽分布特征，并準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。應(yīng)用免疫組化法分別檢測OPN、NF-κB在原發(fā)癌灶和瘤芽的表達(dá)。 結(jié)果：瘤芽位于腫瘤侵襲前沿，是失去極性的去分化癌細(xì)胞，呈孤立或不規(guī)則小梁狀分布。瘤芽BD(+)和OPN在大腸

5、癌原發(fā)癌灶的強(qiáng)陽性表達(dá)在同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移組與無肝轉(zhuǎn)移組間的差異具有顯著性(p＜0.01)。OPN在瘤芽的陽性表達(dá)在同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移組和無肝轉(zhuǎn)移組以及在異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移組和無肝轉(zhuǎn)移組的差異均具有顯著性(p＜0.01)。各組間NF-κB在原發(fā)癌灶、瘤芽的表達(dá)無顯著差別。 結(jié)論：瘤芽BD(+)、OPN在原發(fā)癌灶的強(qiáng)陽性表達(dá)均提示大腸癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的可能性較大。如將瘤芽分布特征結(jié)合OPN的表達(dá)，則可提高預(yù)判的準(zhǔn)確性，可以考慮作為Dukes C期大腸癌

6、術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素。 第二部分離體缺氧模型的制備和鑒定以及缺氧對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29生長活力的影響目的：模擬體內(nèi)腫瘤不同程度的缺氧環(huán)境，建立簡單、穩(wěn)定可靠的離體缺氧模型，比較各梯度缺氧對(duì)HT-29細(xì)胞生長活力及細(xì)胞周期分布的影響，以篩選出最適HT-29細(xì)胞生長的微缺氧環(huán)境。 方法：(1)自制缺氧檢測裝置，灌注不同氧濃度的混合氣體，溶解氧測定儀實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測培養(yǎng)液氧分壓的變化。(2)RT-PCR檢測低培養(yǎng)液氧分壓下HT-

7、29細(xì)胞HIF-1αmRNA的表達(dá)，以檢驗(yàn)細(xì)胞是否處于缺氧狀態(tài)。(3)倒置相差顯微鏡下觀察缺氧各梯度組HT-29細(xì)胞的形態(tài)變化。(4)MTT檢測各梯度缺氧對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響，描繪細(xì)胞生長曲線。(5)流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡比例并計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)。 結(jié)果：(1)輸入7.8％、4.8％、2.4％和1.2％O2后20min，10％FBS/RPMI-1640培養(yǎng)液的PO2分別恒定于30mmHg、20mmHg、

8、10mmHg和5mmHg。(2)缺氧各梯度組HIF-1amRNA的表達(dá)均較對(duì)照組明顯上調(diào)，尤以PO220mmHg組為著。(3)缺氧培養(yǎng)24h后，PO230mmHg、PO220mmHg、PO210mmHg梯度組HT-29細(xì)胞的形態(tài)與對(duì)照組相似，而PO25mmHg梯度組則出現(xiàn)損傷性形態(tài)改變。(4)PO220mmHg梯度組HT-29細(xì)胞的(A570)值明顯高于對(duì)照組，與對(duì)照組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PO230mmHg、PO210

9、mmHg梯度組的(A570)值也高于對(duì)照組，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。各組中，以PO25mmHg梯度組的(A570)值最低。(4)PO220mmHg梯度組HT-29細(xì)胞G2／M期比例仍與對(duì)照組相似，S期則顯著增加(P＜0.05)，PO25mmHg梯度組則出現(xiàn)細(xì)胞周期G0/G1阻滯，S期細(xì)胞明顯減少，凋亡細(xì)胞比例明顯高于其它各組。PO230mmHg、PO210mmHg梯度組的細(xì)胞周期分布雖與對(duì)照組有所不同，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、意義。結(jié)論：(1)本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建離體缺氧模型。(2)在適度缺氧下，由于缺氧的應(yīng)激作用，可能使相關(guān)缺氧反應(yīng)基因表達(dá)上調(diào)，抑制凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖加快，通過刺激增殖和細(xì)胞保護(hù)而使腫瘤細(xì)胞在缺氧環(huán)境中長期生存。而嚴(yán)重缺氧導(dǎo)致細(xì)胞周期G1/S阻滯，細(xì)胞凋亡比例增加，增殖受到抑制，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)損傷性改變。(3)在對(duì)照組和缺氧的4個(gè)梯度組中，PO220mmHg組處于缺氧的應(yīng)激和損傷作用的平衡點(diǎn)，其生長活力最好。腫瘤瘤體內(nèi)PO220mmHg位于瘤體邊緣

11、，提示：位于瘤體邊緣的腫瘤細(xì)胞在缺氧的誘導(dǎo)下增殖活性更強(qiáng)。這為后續(xù)深入探討該缺氧水平下腫瘤細(xì)胞的侵襲能力及其機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 第三部分微缺氧對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-290PN和NF-kB表達(dá)及其侵襲能力的影響目的：觀察HT-29細(xì)胞在微缺氧下的侵襲能力，檢測OPN、NF-kB/p65的表達(dá)和MMP-2/9的活性變化，以探討其向惡性表型轉(zhuǎn)化的潛在機(jī)制。 方法：(1)參照體內(nèi)腫瘤瘤體邊緣的氧分壓(PO220mmHg)，建立微缺氧

12、模型。(2)MTT比色試驗(yàn)測定HT-29細(xì)胞的異質(zhì)性粘附能力。(3)Transwell侵襲試驗(yàn)判定微缺氧下細(xì)胞的侵襲游走能力。(4)內(nèi)皮細(xì)胞小管形成試驗(yàn)檢測體外促進(jìn)新生血管形成的能力。(5)將HT-29細(xì)胞微缺氧處理0、6、12、24、48h，明膠酶譜分析檢測分泌的MMP-2/9活性：RT-PCR和Western blot檢測OPN mRNA和蛋白表達(dá)；提取胞核蛋白，Western blot檢測胞核內(nèi)NF-κB/p65蛋白表達(dá)。

13、 結(jié)論：微缺氧能誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞異質(zhì)性粘附能力、侵襲游走能力顯著增加，促進(jìn)新生血管形成，上調(diào)MMP-2/9活性而促進(jìn)其向惡性表型轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)檢測到在微缺氧下OPN、胞核內(nèi)NF-κB/p65和MMP2/9普遍上調(diào)，且時(shí)限同步，因此，我們推測：OPN-NF-κB可能是微缺氧下繼HIF-1α之外的另一重要調(diào)控途徑，該調(diào)控途徑與微缺氧誘導(dǎo)的惡性表型密切相關(guān)。 第四部分OPN反義寡核苷酸對(duì)微缺氧下人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29體外侵襲轉(zhuǎn)移潛能的

14、影響目的：觀察靶向OPN的反義寡核苷酸(ASODN)對(duì)微缺氧下HT-29細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能等的影響，探討OPN與微缺氧誘導(dǎo)的腫瘤惡性表型的關(guān)系。 方法：(1)合成ASODN，以Lipofectamine為載體，將其轉(zhuǎn)染入微缺氧下高表達(dá)OPN的HT-29細(xì)胞。(2)Western blot行OPN ASODN抑制OPN蛋白表達(dá)的量效關(guān)系和特異性分析。(3)RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞微缺氧下OPNmRNA的表達(dá)。(4)MTT檢測轉(zhuǎn)染的H

15、T-29細(xì)胞微缺氧下的增殖活性。(5)HT-29細(xì)胞的異質(zhì)性粘附能力、侵襲游走能力、促進(jìn)新生血管形成的能力、OPNmRNA表達(dá)和胞核內(nèi)NF-kB/p65蛋白表達(dá)的檢測方法同前。 結(jié)論：靶向OPN的ASODN明顯抑制微缺氧誘導(dǎo)的OPNmRNA和蛋白表達(dá)，并顯著拮抗微缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、異質(zhì)性黏附、侵襲游走和新生血管形成，OPN在微缺氧促進(jìn)腫瘤向惡性表型轉(zhuǎn)化中起著重要作用；阻抑OPN的表達(dá)，胞核內(nèi)NF-κB/p65表達(dá)、MMP2/9