microR-21反義寡核苷酸對(duì)人大腸癌HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用及化放療敏感性的影響.pdf

1、目的:
　　觀察慢病毒介導(dǎo)miR-21反義寡核苷酸下調(diào)大腸癌HT-29細(xì)胞內(nèi)miR-21表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為及化放療敏感性的影響。探討miR-21成為大腸癌靶向治療的新靶點(diǎn)的可能性。
　　方法:
　　構(gòu)建含miR-21反義寡核苷酸的慢病毒載體，通過(guò)慢病毒感染將miR-21ASO片段導(dǎo)入大腸癌HT-29細(xì)胞內(nèi)下調(diào)miR-21表達(dá)，將轉(zhuǎn)染miR-21ASO組作為實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)正常HT-29細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組（Control組

2、）、轉(zhuǎn)染空載慢病毒組(HT-29/NC組)、轉(zhuǎn)染U6snRNA組(HT-29/U6組)為對(duì)照組，用探針?lè)≒CR檢測(cè)各組HT-29細(xì)胞內(nèi)miR-21表達(dá)差異，驗(yàn)證經(jīng)轉(zhuǎn)染慢病毒載體后，實(shí)驗(yàn)組miR-21表達(dá)下調(diào)，再篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)各實(shí)驗(yàn)以研究下調(diào)HT-29細(xì)胞內(nèi)miR-21表達(dá)后其生物學(xué)行為的變化以及對(duì)放化療敏感性的影響。即通過(guò)細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞細(xì)胞周期變化及細(xì)胞凋亡率是否有差異，通過(guò)

3、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)收集各組細(xì)胞克隆形成率來(lái)分析細(xì)胞克隆形成情況，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，MTT法檢測(cè)不同梯度藥物濃度的腫瘤抑制率，以及經(jīng)總量10GyX線(xiàn)照射后各組腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。
　　結(jié)果:
　　1、轉(zhuǎn)染miR-21ASO的實(shí)驗(yàn)組較正常HT-29細(xì)胞組miR-21表達(dá)明顯下降，具有顯著差異（P值＜0.01）;轉(zhuǎn)染空載慢病毒組及U6snRNA對(duì)照組與正常組miR-21表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　2、通過(guò)

4、細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法連續(xù)7天分別計(jì)數(shù)各組細(xì)胞數(shù)目，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，HT-29/ASO組細(xì)胞增殖速率相較于其他各對(duì)照組細(xì)胞明顯更低，(P值＜0.01)，而Control組、NC組、U6組各組間無(wú)顯著差異。
　　3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-21ASO后細(xì)胞早期凋亡率較對(duì)照組明顯增加，G0/G1期所占細(xì)胞總數(shù)百分比上升，而S期細(xì)胞百分比下降。
　　4、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示HT-29/ASO組細(xì)胞克隆形成率明顯低于HT-29組

5、、HT-29/NC組及HT-29/U6組（P值＜0.01），而HT-29組、HT-29/NC組及HT-29/U6組之間細(xì)胞克隆形成率無(wú)顯著差異。
　　5、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染miR-21ASO的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲能力明顯低于對(duì)照組，下調(diào)miR-21表達(dá)的HT-29/ASO組穿過(guò)Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)最少，與其他各組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值＜0.01），HT-29/NC組及HT-29/U6組與未轉(zhuǎn)染慢病毒Control組無(wú)明顯差異

6、（P值＞0.05）。
　　6、MTT法檢測(cè)下調(diào)miR-21后HT-29細(xì)胞對(duì)5-FU藥物敏感性實(shí)驗(yàn)顯示，在不同5-FU藥物濃度下，HT-29/ASO轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率較各對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值＜0.01），HT-29/ASO組增敏倍數(shù)為2.35倍。
　　7、MTT法檢測(cè)下調(diào)miR-21后HT-29細(xì)胞對(duì)放療敏感性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，總量10GyX線(xiàn)照射后HT-29/ASO組腫瘤細(xì)胞抑制率明顯高