Twist基因質(zhì)粒載體構(gòu)建及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建穩(wěn)定、高表達(dá)的Twist基因真核表達(dá)質(zhì)粒載體，研究Twist基因在惡性腫瘤細(xì)胞侵襲中的作用及其機(jī)制。
　　 方法：①以質(zhì)粒pcDNA4/myc-His A-Twist為模板采用PCR技術(shù)獲取Twist基因全長(zhǎng)編碼框架，運(yùn)用雙酶切、定向克隆技術(shù)將目的片段亞克隆入質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD，構(gòu)建質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD-Twist。②培養(yǎng)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株，運(yùn)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染S

2、W480結(jié)腸癌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組：質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD-Twist組、質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD組和未轉(zhuǎn)染組。③轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收獲細(xì)胞，運(yùn)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞Twist基因的mRNA表達(dá)水平；Wester blot技術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞的Twist蛋白表達(dá)水平。④采用Transwell小室模型檢測(cè)三組癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　 結(jié)果：①經(jīng)雙酶切、基因測(cè)序等檢測(cè)方法證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建Twist基因真核表

3、達(dá)質(zhì)粒載體pTracer-CMV/BSD-Twist。②倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染48小室腫瘤細(xì)胞可見(jiàn)質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD-Twist組和質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD組表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞，強(qiáng)度高而密集。③熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)三組細(xì)胞Twist基因mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD-Twist組Twist基因mRNA表達(dá)水平高于質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD組和未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

4、義（P<0.01），而質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD組和未轉(zhuǎn)染組比較Twist基因mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。④Western blot檢測(cè)三組細(xì)胞Twsit蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD-Twist組Twist蛋白表達(dá)水平高于質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD組和未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD組和未轉(zhuǎn)染組比較Twist蛋白表達(dá)水平差異

5、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。⑤Transwell小室模型檢測(cè)三組細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD-Twist組細(xì)胞侵襲能力高于質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD組和未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD組和未轉(zhuǎn)染組比較細(xì)胞侵襲能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 結(jié)論：①成功構(gòu)建Twist基因真核表達(dá)質(zhì)粒載體pTracer-CMV/BSD-Twist，并