SIRT5基因沉默對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響.pdf

1、結(jié)腸癌是臨床常見惡性腫瘤之一。每年約有120萬新發(fā)病例，60萬人死于結(jié)腸癌，在女性腫瘤發(fā)病率中高居第二，男性腫瘤發(fā)病率也排名第三位，近十年我國結(jié)腸癌發(fā)病率不斷增加。由于起病隱匿，結(jié)腸癌具有發(fā)現(xiàn)晚，放療、化療、手術(shù)切除效果差，預(yù)后不良等特點(diǎn)。造成這種結(jié)果的主要原因?yàn)榻Y(jié)腸癌細(xì)胞的高度侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力。目前，其侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不完全明確。因此，有必要對結(jié)腸癌進(jìn)行深入探索，闡明結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移侵襲的具體分子機(jī)制，為臨床中結(jié)腸癌的早期診斷、轉(zhuǎn)移預(yù)

2、測和有效治療提供新的策略。
　　蛋白質(zhì)乙酰化和去乙?；膭討B(tài)平衡參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多種重要途徑，蛋白質(zhì)去乙?；膶?shí)現(xiàn)有賴于去乙?；傅拇呋?。沉默信息調(diào)節(jié)因子2是首先發(fā)現(xiàn)于酵母菌種的一種高度保守的組蛋白去乙?；福溉閯游镏械某聊畔⒄{(diào)節(jié)因子2稱為Sirtuins，包括SIRT1-7。研究表明，Sirtuins通過去乙?；M蛋白和眾多的非組蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞壽命、能量代謝、炎癥反應(yīng)以及增殖、凋亡等。SIRT5是目前研究最少的Sirt

3、uins家族成員。由于和其他Sirtuins的同源性，SIRT5首先被認(rèn)為是一個去乙酰化酶。后來發(fā)現(xiàn)，其去乙?；富钚暂^低，反而具有去琥珀酰化、去丙二?；⑷ノ於；富钚?。線粒體是存在于身體幾乎所有細(xì)胞中的一種細(xì)胞器，主要負(fù)責(zé)能量生成和調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。作為位于線粒體內(nèi)的Sirtuins家族最特殊的成員之一，SIRT5通過其多種酶活性作用于包括CPS1、細(xì)胞色素C、丙二酰輔酶A、SOD1在內(nèi)的多種底物，參與線粒體內(nèi)的多種代謝和細(xì)胞凋亡，

4、起到調(diào)節(jié)線粒體代謝、細(xì)胞周期調(diào)控等多種作用。
　　與一系列關(guān)于SIRT5在代謝中作用的研究相比，關(guān)于SIRT5與腫瘤關(guān)系的研究報(bào)道極少。最近一篇關(guān)于人類高分化漿液性卵巢癌的研究表明，在30％的病例中發(fā)現(xiàn)了SIRT5的高表達(dá)。另一研究指出，在進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌中，發(fā)現(xiàn)了SIRT5的高表達(dá)，并指出通過對NRF2及其下游靶目標(biāo)的作用，SIRT5有促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長、增殖、增加耐藥性的作用。目前 SIRT5在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制的研

5、究尚無報(bào)道。本研究旨在明確SIRT5在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況，探討SIRT5對結(jié)腸癌生物學(xué)表型的影響及可能的分子機(jī)制，為闡明SIRT5在結(jié)腸癌診斷、治療中的作用提供潛在的理論基礎(chǔ)。
　　本研究首先采用RT-PCR技術(shù)、Western blotting和免疫組化染色技術(shù)等檢測結(jié)腸腺癌及配對癌旁結(jié)腸黏膜組織中SIRT5 mRNA和蛋白表達(dá)水平，并分析SIRT5表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性；然后利用RNA干擾技術(shù)，靶向沉默SIRT

6、5基因的表達(dá)，Western blotting檢測SIRT5基因沉默效果，篩選出后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)用的結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和HCT-15；克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測SIRT5沉默后對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測SIRT5沉默后對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響，分析SIRT5表達(dá)變化對結(jié)腸癌LoVo和HCT-15細(xì)胞增殖、凋亡的影響；接著應(yīng)用細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測SIRT5沉默對結(jié)腸癌LoVo和HCT-15細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，同時研究SIRT5沉默對結(jié)腸癌Lo

7、Vo和HCT-15細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)指標(biāo)蛋白（E-cadherin、N-cadherin及Vimentin)的表達(dá)以及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2、MMP9）表達(dá)水平的影響。為明確SIRT5沉默對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響是否與PTEN/AKT信號傳導(dǎo)通路有關(guān)，我們對比了SIRT5沉默組與對照組PTEN/AKT信號通路的改變，進(jìn)一步分析了試驗(yàn)結(jié)論所發(fā)生的分子機(jī)制，

8、探討其潛在的臨床價值。
　　總之，本實(shí)驗(yàn)以 SIRT5為靶點(diǎn)，探討其對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，及其可能的分子機(jī)制，共分為4個部分。
　　第一部分：SIRT5在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其預(yù)后分析
　　方法
　　1.收集結(jié)腸癌及癌旁組織的臨床標(biāo)本和相關(guān)臨床病理資料，采用RT-PCR和Westen blotting實(shí)驗(yàn)方法檢測并分析結(jié)腸癌組織、癌旁正常組織中SIRT5 mRNA和SIRT5蛋白的表達(dá)水平，采用χ2檢驗(yàn)比

9、較在結(jié)腸癌及癌旁組織中SIRT5mRNA和SIRT5蛋白的表達(dá)水平的差異。
　　2.利用多組單因素回歸分析，分析SIRT5的表達(dá)與結(jié)腸癌瘤體大小、分化程度、TNM分期及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移情況等臨床病理特征之間有無相關(guān)性。
　　結(jié)果
　　1.結(jié)腸癌組織中SIRT5 mRNA、SIRT5蛋白表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁組織。
　　2.免疫組化結(jié)果顯示，SIRT5在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平高于相應(yīng)的癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時

10、，SIRT5表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者某些病理學(xué)特征存在相關(guān)性，具體如下：SIRT5的染色評分與瘤體大?。≒=0.026）、分化程度（P=0.041）、TNM分期（P=0.005）及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移（P=0.018）情況密切相關(guān)，瘤體越大、分化程度約差、TNM分期越高、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，癌組織中SIRT5的染色程度越明顯，但SIRT5的染色程度與患者年齡（P=0.552）、性別（P=0.636）及淋巴轉(zhuǎn)移（P=0.701）情況無關(guān)。
　　第二部

11、分：SIRT5沉默對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響
　　方法
　　1.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表達(dá)，檢測結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-15、HT-29、SW480、LoVo中SIRT5的表達(dá)水平，篩選出沉默效果較好的LoVo細(xì)胞和HCT-15細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　2.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表達(dá)，通過CCK-8細(xì)胞增殖檢測、克隆形成實(shí)驗(yàn)，觀察SIRT5表達(dá)變化對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-15和LoVo增殖、克隆形成能力的

12、影響。
　　3.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測SIRT5沉默的結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT-15和LoVo的凋亡細(xì)胞比例，觀察 SIRT5表達(dá)變化對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-15和LoVo凋亡能力的影響。
　　結(jié)果
　　1. siRNA轉(zhuǎn)染可成功下調(diào)SIRT5基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平（P<0.05）。與其他結(jié)腸癌細(xì)胞系相比，SIRT5在人結(jié)腸癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系LoVo中，mRNA和蛋白表達(dá)水平都呈高表達(dá)，差異存在

13、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　2. SIRT5基因沉默后，結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和HCT-15的細(xì)胞增殖能力下降，克隆形成數(shù)目減少（P<0.05）。
　　3. SIRT5基因沉默后，結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和HCT-15的凋亡比例增加（P<0.05）。
　　第三部分：SIRT5沉默對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響
　　方法
　　1.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表達(dá)，通過Wound healing試驗(yàn)（劃痕試驗(yàn)

14、），檢測SIRT5基因沉默對結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和HCT-15遷移能力的影響。
　　2.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表達(dá)，通過Transwell侵襲試驗(yàn)，檢測SIRT5基因沉默對結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和HCT-15侵襲能力的影響。
　　3.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表達(dá)，通過Western Blotting法檢測SIRT5基因沉默后，結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和HCT-15上皮屬性蛋白E-cadherin以及間質(zhì)屬性蛋白N-

15、cadherin、Vimentin以及金屬基質(zhì)蛋白MMP2、MMP9的表達(dá)水平，評價SIRT5在結(jié)腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用。
　　4.所有數(shù)據(jù)均采用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1. SIRT5基因沉默后，結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和HCT-15的遷移能力降低（P<0.05）。
　　2.SIRT5基因沉默后，結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和H

16、CT-15的侵襲能力降低（P<0.05）。
　　3.SIRT5基因沉默后，結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和HCT-15中上皮屬性蛋白E-cadherin表達(dá)升高，間質(zhì)屬性蛋白N-cadherin、Vimentin的表達(dá)下降，金屬基質(zhì)蛋白MMP2及MMP9表達(dá)降低（P<0.05）。
　　第四部分：SIRT5沉默對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移影響的機(jī)制研究
　　方法
　　1.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表達(dá)，觀察SIRT5基

17、因沉默后，結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和HCT-15中PTEN表達(dá)和AKT磷酸化水平的變化。
　　2.通過聯(lián)合干擾SIRT5、PTEN的表達(dá)，檢測LoVo和HCT-15細(xì)胞中AKT磷酸化水平的改變，明確SIRT5是否通過PTEN/AKT通路影響結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)果
　　1. SIRT5基因沉默后，結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和HCT-15中PTEN表達(dá)均上調(diào)，同時AKT的磷酸化的水平受到抑制（P<0.05）。
　　2

18、.聯(lián)合干擾 SIRT5、PTEN的表達(dá)后，結(jié)腸癌細(xì)胞 LoVo和HCT-15中，SIRT5-shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)株中瞬時轉(zhuǎn)染PTEN-siRNA組較單獨(dú)SIRT5-shRNA組AKT磷酸化水平均發(fā)生上調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論
　　1.結(jié)腸癌組織中SIRT5 mRNA、SIRT5蛋白表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁組織，且與某些病理學(xué)特征有關(guān)，SIRT5基因可在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲遷移中發(fā)揮重要作用，成為結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后評估的分子