吳茱萸堿通過(guò)SIRT1影響人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、結(jié)腸癌作為一種常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤，其發(fā)病率居全球常見(jiàn)惡性腫瘤的第三位。目前臨床上治療結(jié)腸癌的首選方法為手術(shù)切除并輔以化療，盡管化療對(duì)癌細(xì)胞有直接的殺滅作用，但也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成一定的損傷且易于復(fù)發(fā)，部分病人因承受不了化療的痛苦而放棄治療甚至因化療致死。因而尋找一種新型低毒高效的抗結(jié)腸癌藥物迫在眉睫。
　　吳茱萸堿（Evodiamine, Evo）是從吳茱萸干燥果實(shí)中提取的生物堿，近年來(lái)的研究表明其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤藥

2、物活性，但目前對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制的報(bào)道較少。
　　沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator1, SIRT1）是sirtuin家族中的組蛋白脫乙酰酶，它是酵母沉默信號(hào)調(diào)節(jié)因2（silencing information regulator2，sir2）在人體中的類似物。SIRT1能夠依賴NAD+使多種蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基發(fā)生去乙?；?，隸屬于第 III類去乙?；讣?Sirtuin家族。S

3、IRT1主要通過(guò)組蛋白H1上賴氨酸殘基k26脫乙?；?、組蛋白H3上賴氨酸殘基k9脫乙酰化、組蛋白H4上賴氨酸殘基k16脫乙?；饔脕?lái)修飾組蛋白。有研究報(bào)道，SIRT1在前列腺癌、原發(fā)性結(jié)腸癌、急性髓性白血病中均明顯過(guò)表達(dá)。此外，SIRT1在鱗狀上皮細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌中也高表達(dá)。王澈等研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿可以抑制人黑色素瘤A375 S2細(xì)胞SIRT1的表達(dá)。
　　NF-кB( nuclear factor-kappaB)是一種細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄

4、因子，近幾年大量的研究表明，NF-кB與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移密切關(guān)系,因此備受廣大學(xué)者的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn) SIRT1能夠在NAD+的輔助下對(duì) NF-кB亞基脫乙?；撘阴；?NF-кB無(wú)法與IкBα結(jié)合，其核定位信號(hào)無(wú)法暴露，難以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與特定基因的啟動(dòng)子區(qū)域（5-'GGGACTTTCC-3')結(jié)合,啟動(dòng)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等的特定基因的轉(zhuǎn)錄。
　　MMPs家族蛋白參與腫瘤的遷移過(guò)程。Wen等報(bào)

5、道，SIRT1可誘導(dǎo) MMPs家族中 MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。另外也有報(bào)道稱，磷酸化的NF-кB可以直接與MMP-9啟動(dòng)子結(jié)合從而調(diào)節(jié)核內(nèi)MMP-9的合成。
　　既然SIRT1和NF-кB都與MMP-9有著密切關(guān)系，且MMP-9作為SIRT1和 NF-кB共同的下游蛋白存在，因此，我們提出假設(shè)：SIRT1在NF-кB和MMP-9所致的腫瘤遷移中起到至關(guān)重要的作用。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌HCT-116和H

6、T-29細(xì)胞株，分別加入Evo1.5、3、6、12、24、48、96μmol·L-1繼續(xù)培養(yǎng)48 h，CCK-8法檢測(cè)Evo對(duì)HCT-116和 HT-29細(xì)胞生存活性的影響；Transwell法和劃痕法檢測(cè)Nampt（SIRT1） Evo對(duì) HCT-116和 HT-29細(xì)胞體外遷移的影響；RT-PCR和Western Blot檢測(cè)不同濃度的Evo（1.5、3、6μmol·L-1）和Nampt（10μg·L-1）誘導(dǎo)HCT-116和HT-

7、29細(xì)胞48h后，細(xì)胞中SIRT1、NF-кB、MMP-9蛋白的表達(dá)情況。將 HCT-116細(xì)胞接種到4周齡的Balb/c裸小鼠右下腹部，荷瘤直徑生長(zhǎng)到約0.5cm后，Evo（3mg/Kg）灌胃治療（每天一次），并監(jiān)測(cè)瘤體直徑及小鼠體重，治療22天后收集標(biāo)本，計(jì)數(shù)結(jié)腸轉(zhuǎn)移瘤個(gè)數(shù)；HE染色觀察荷瘤細(xì)胞的形態(tài)改變，免疫組化和Western Blot檢測(cè)SIRT1、NF-кB/P65、MMP-9蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1

8、.不同濃度的Evo（1.5、3、6、12、24、48、96μmol·L-1）作用于HCT-116和HT-29細(xì)胞48h后，兩種細(xì)胞的增殖均受到明顯抑制（P＜0.05），且在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性；且 Evo能抑制 HCT-116和HT-29細(xì)胞的遷移。
　　2. Evo可明顯下調(diào)HCT-116和HT-29細(xì)胞內(nèi)SIRT1、MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)，上調(diào)NF-кB mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　3. Evo組的荷瘤重（0

9、.63±0.13）g，明顯低于模型組（3.00±0.57） g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Evo組的瘤體積（941.98±122.59） mm3顯著小于模型組（1563.48±240.90）mm3（P＜0.01）；Evo組小鼠的體重（25.60±0.63）g明顯大于模型組（15.54±0.50）g，且有統(tǒng)計(jì)差異（P＜0.01）。HE染色結(jié)果顯示：在荷瘤小鼠體內(nèi), Evo能顯著加快荷瘤細(xì)胞中核的固縮，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　4.