MMP9-PEX的原核表達及對結(jié)腸癌細胞侵襲能力的影響.pdf

1、PEX存在于大多數(shù)MMPs羧基末端，是多種物質(zhì)的結(jié)合位點，它的突變對1VI]VIPs功能有著重要的影響。并且它可通過]V[MPs的自身作用被降解，產(chǎn)生一分子質(zhì)量為29kDa32kDa的PEX片段。在各種人類膠質(zhì)瘤、內(nèi)皮、乳房和前列腺的癌細胞系的培養(yǎng)基中都可以檢測到PEX片段。PEX片段是IV[]VIPs的內(nèi)源性活化抑制劑，在不同病理生理條件下可以抑制血管生成。 在腫瘤的轉(zhuǎn)移和胚胎植入的過程中，1V[~／[Ps起到了很大的作用尤其

2、是MMP2和MMP9，它們通過降解ECM來促進腫瘤和滋養(yǎng)層細胞的侵襲。作為～MMPs的內(nèi)源性活化抑制劑，PEX在這些過程中可能也會起著重要的作用，但其在胚胎植入中的功能卻知之甚少。 目的：本實驗通過構(gòu)建pET32a／PEX原核表達質(zhì)粒，表達并提純重組蛋白，為進一步研究PEX基因的功能和蛋白的作用奠定基礎。并采用Transwll實驗，分析重組蛋白pET32a／PEX對結(jié)腸癌細胞侵襲的影響及其對侵襲影響的劑量關系，探討其作用機理，為

3、將來探尋PEX在胚胎發(fā)育、胚胎植入和腫瘤侵襲中的作用奠定良好的實驗基礎。 方法：1．RT-PCR法擴增MMP9-PEX基因，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后克隆入原核表達載體pET32a中，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒并進行酶切和DNA雙向測序鑒定。2．將重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達，用SDS-PAGE鑒定，用尿素裂解緩沖液溶解包含體并采用親和層析有效分離出目標蛋白。3．采用Transwll實驗觀察重組蛋白pET32a／PEX對結(jié)腸癌細胞侵襲過程的影響及對

4、侵襲影響的劑量關系。 結(jié)果：1．RT-PCR擴增片段大小與預期的MMP9-PEX片段大小(594bp)相同，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET32a／PEX經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，DNA雙向測序證實與其序列一致。2．重組質(zhì)粒在大腸桿菌中高效表達，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE方法鑒定為42KD的pET32a／PEX融合蛋白，目的蛋白含量占菌體總蛋白含量的50％左右，經(jīng)純化后得到純度為90％以上的融合蛋白。3．結(jié)腸癌細胞侵襲的抑制呈劑量依賴性，發(fā)現(xiàn)當融

5、合蛋白pET32a／PEX重組蛋白的濃度為100ug／ml時，對細胞侵襲能力的抑制達到最高峰，約93％的細胞侵襲能力受到抑制；而當濃度升高到500ug／ml時抑制率有所下降，為76％。 結(jié)論：1．利用pET32a表達載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET32a／PEX，能高效表達重組蛋白pET32a／PEX。而且運用親和層析技術能使目標蛋白得到有效的分離。2．實驗結(jié)果表明，重組蛋白pET32a／PEX能抑制結(jié)腸癌細胞侵襲，說明利用原核系統(tǒng)可得