Twist基因?qū)ξ赴┘?xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、胃癌是一種嚴(yán)重危害人們生命健康的常見(jiàn)腫瘤，它的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。TWist蛋白是屬于堿性的螺旋一環(huán)一螺旋蛋白家族中的高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Twist被認(rèn)為是癌基因蛋白，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡。Twist作為上皮一間質(zhì)轉(zhuǎn)型(epithelial-mesenchymal.transition，EMT)過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，對(duì)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有重要影響。盡管目前已積累了一些有關(guān)TWist的研究，但是Twist對(duì)胃癌細(xì)

2、胞侵襲和轉(zhuǎn)移有何影響卻知之較少。 目的：研究Twist基因轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，探討Twist在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制。 方法：通過(guò)細(xì)菌轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切、凝膠電泳、基因測(cè)序鑒定TWist正義質(zhì)粒；利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染SGC7901胃癌細(xì)胞株，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定高表達(dá)Twist的TwistS-SGC7901(PcDNA3-Twist轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞)細(xì)胞模型；采用RT-PCR方法檢測(cè)

3、三組細(xì)胞中TWist的mRNA水平；采用免疫熒光和和Western blot分析法檢測(cè)三組細(xì)胞中Twist的表達(dá)；經(jīng)RT-PCR分析TWist轉(zhuǎn)染對(duì)EmT標(biāo)記物(Ecadherin，α-SMA)表達(dá)的影響；采用MTT比色法測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的黏附能力，Boyden小室測(cè)定法測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力；腹腔移植法建立裸鼠胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型。采用免疫熒光檢測(cè)三組細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)及定位；用EMSA方法檢測(cè)Tcf一4/Lef的DNA

4、結(jié)合活性；用RT-PCR分析Tcf-4下游靶基因cyclinDl的表達(dá)；用Western blot分析Tcf-4下游靶基因vimentin、mmp-2的表達(dá)。用ELISA方法分析Tcf-4下游靶基因VEGF的表達(dá)。 通過(guò)細(xì)菌轉(zhuǎn)化、提取Twist反義質(zhì)粒；利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染MKN45胃癌細(xì)胞株，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定低表達(dá)Twist的TwistAS-MKN45(PcDNA3-TwistAS轉(zhuǎn)染的MKN45細(xì)胞)細(xì)胞模型；采

5、用RT-PcR方法檢測(cè)三組細(xì)胞中Twist的mRNA水平；采用Western blot分析法檢測(cè)三組細(xì)胞中Twist的表達(dá)。用EMSA方法檢測(cè)Tcf-4/Lef的DNA結(jié)合活性；用RT-PCR分析Tcf-4下游靶基因cyclinDl的表達(dá)；Western blot分析Tcf-4下游靶基因vimentin和mmp-2的表達(dá)。用ELISA方法分析Tcf-4下游靶基因VEGF的表達(dá)。用Western-blot分析了E-cadherin的表達(dá)。

6、 利用免疫組織化學(xué)方法分析了Twist和Ecadherin在76例胃癌中的表達(dá)水平及其和臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。 結(jié)果：成功建立了Twist穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞模型(TwistS-S6C7901)；與SGC7901細(xì)胞及PcDNA3-SGC7901細(xì)胞相比較，TwistS-SGC7901細(xì)胞的黏附能力、遷移能力、侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力明顯提高(p<0.05)：Twist能夠促進(jìn)SGC7901細(xì)胞發(fā)生EMTt Twist正義質(zhì)粒轉(zhuǎn)

7、染能夠增強(qiáng)SGC7901細(xì)胞TCF-4轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性；并且能夠提高TCF-4轉(zhuǎn)錄因子下游靶基因cyclinDl、VEGF、vimentin和mmp-2的表達(dá)。 成功建立了Twist穩(wěn)定低表達(dá)的細(xì)胞模型(TwistAS-MKN45)；Twist反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能夠降低MKN45細(xì)胞TCF-4轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性；并且能夠降低TCF-4轉(zhuǎn)錄因子下游靶基因cyclinDl、VEGF、vimentin和mmp-2的表達(dá)。

8、 Twist蛋白陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核；Twist蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為60.52％，遠(yuǎn)癌斷端胃粘膜的表達(dá)陰性，且與胃癌分化程度、浸潤(rùn)范圍以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，但是和年齡、性別無(wú)關(guān)。Ecadherin蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為47.37％，低于遠(yuǎn)癌斷端胃粘膜的表達(dá)水平(100％)，Ecadherin蛋白的表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別無(wú)關(guān)。Twist蛋白

9、的表達(dá)與Ecadherin蛋白呈負(fù)相關(guān)。 結(jié)論： 1.Twist基因高表達(dá)能夠增強(qiáng)SGC7901細(xì)胞的黏附能力、遷移能力、侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力。 2.TWist基因能促進(jìn)SGC7901細(xì)胞EMT。 3.Twist基因促進(jìn)SGC7901細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移可能通過(guò)正調(diào)控Wnt信號(hào)通路而發(fā)揮作用。 4.TWist、E-cadherin在胃癌組織中的表達(dá)和胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。TWist