ZEB2對胃癌侵襲轉移的影響及其機制的研究.pdf

1、第一章ZEB2、E-cadherin在胃癌組織和胃癌細胞株中的表達及意義
　　 目的:研究ZEB2、E-cadherin在胃癌組織和胃癌細胞株中的表達及其意義。
　　 方法:采用免疫組織化學法檢測胃癌組織及非癌性胃黏膜組織中ZEB2、E-cadherin蛋白的表達，分析ZEB2和E-cadherin的表達與臨床病理參數(shù)的關系，用Kaplan-Meier和Cox回歸分析法進行生存分析。采用實時定量PCR法檢測人胃黏膜上皮細

2、胞株GES-1及胃癌細胞株SGC7901和HGC27中ZEB2mRNA和E-cadherinmRNA的表達。
　　 結果:
　　 1.在胃癌組織中ZEB2陽性表達率(59.2％)明顯高于非癌性胃組織(19.0％)，其表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期有關(P＜0.05)，與年齡、性別、腫瘤大小和分化程度無關(P＞0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示，ZEB2陽性表達組、陰性表達組患者術后平均生存時間分

3、別為37.603±3.909mo，52.258±4.046mo;ZEB2陽性表達組患者的5年生存率明顯低于陰性表達組患者，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2.在胃癌組織中E-cadherin陽性表達率(56.6％)明顯低于非癌性胃組織(100％)，其表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期有關(P＜0.05);與年齡、性別和腫瘤大小無關(P＞0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示，E-cadher

4、in陽性表達組、陰性表達組患者術后平均生存時間分別為52.473±3.675mo，32.667±4.225mo;E-cadherin陽性表達組患者的5年生存率明顯高于陰性表達組患者，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3.ZEB2與E-cadherin在胃癌組織中的表達呈負相關性(r=-0.295，P=0.01)。
　　 4.胃癌細胞株中ZEB2mRNA的相對表達量高于人胃黏膜上皮細胞株GES-1(P＜0.05)，

5、且胃癌細胞株HGC27中ZEB2mRNA相對表達量最高。
　　 5.胃癌細胞株中E-cadherinmRNA的相對表達量低于人胃黏膜膜上皮細胞株GES-1(P＜0.05)，且胃癌細胞株HGC27中E-cadherinmRNA相對表達量最低。
　　 結論:
　　 1.胃癌組織和胃癌細胞株中均存在ZEB2的高表達和E-cadherin的下調表達，其可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。
　　 2.ZEB2、E-cad

6、herin在胃癌組織中的表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期及預后相關，其異常表達可能參與胃黏膜的惡性轉變，在胃癌浸潤轉移中起一定的作用。
　　 3.在胃癌組織中ZEB2與E-cadherin的表達呈負相關性，ZEB2可能通過抑制E-cadherin的表達促進胃癌的轉移。
　　 第二章靶向ZEB2基因的shRNA表達載體的構建及鑒定
　　 目的:構建靶向ZEB2基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)真核表達質粒，

7、并進一步研究其對人胃癌HGC27細胞ZEB2表達的抑制效應。
　　 方法:設計3條靶向ZEB2基因的shRNA，經退火成互補雙鏈，克隆到質粒pGPU6/GFP/Neo中構建重組載體(pGPU6/GFP/Neo-ZEB2-shRNA1，2，3)，經酶切鑒定和測序確認后，將3個重組表達載體利用脂質體轉染到人胃癌細胞株HGC27，采用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達，利用Real-timePCR，Westernblot法檢測轉染前后Z

8、EB2mRNA和蛋白表達的情況，并篩選出最佳抑制效率的shRNA表達質粒。
　　 結果:
　　 1.通過酶切鑒定和測序分析，靶向ZEB2基因的3個pGPU6/GFP/Neo-shRNA重組載體構建成功。
　　 2.重組質粒轉染HGC27細胞后，經Real-timePCR檢測，3個重組表達載體pGPU6/GFP/Neo-ZEB2-shRNA1，2，3對ZEB2mRNA表達的抑制率分別為81％，42％，74％;經We

9、sternblot檢測，3個重組表達載體pGPU6/GFP/Neo-ZEB2-shRNA1，2，3對ZEB2蛋白表達的抑制率分別為73％，33％，64％;與空白對照組（HGC27細胞）相比較，質粒ZEB2-shRNA1抑制ZEB2表達的效應最佳，有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.成功構建靶向ZEB2基因的shRNA真核表達質粒。
　　 2.構建的3個重組表達載體均可有效抑制HGC27細胞中Z

10、EB2的表達，其中ZEB2-shRNA1抑制效果最強，為后續(xù)研究打下了基礎。
　　 第三章ZEB2基因沉默對HGC27細胞生物學行為的影響及其機制的研究
　　 目的:研究RNAi介導ZEB2基因沉默對人胃癌HGC27細胞增殖、侵襲及遷移等細胞生物學行為的影響及其機制。
　　 方法:實驗細胞分為3組，即轉染陽性重組質粒ZEB2-shRNA1的實驗組，轉染陰性質粒ZEB2-shRNANC的陰性對照組和未轉染的的空白對

11、照組。分別檢測ZEB2下調前后的人胃癌HGC27細胞生物學行為的變化，采用MTT法檢測細胞增殖情況;Transwell小室測定細胞的遷移和侵襲能力;經Westernblot法分析ZEB2基因沉默對EMT上皮標志物E-cadherin，間質標志物fibronecin，vimentin及其MMPs家族中MMP2，MMP9蛋白表達的影響。
　　 結果:
　　 1.MTT結果顯示，與空白對照組，陰性對照組比較，實驗組中HGC27

12、細胞的增殖能力無明顯改變(P＞0.05)。
　　 2.細胞侵襲實驗中，實驗組HGC27細胞穿膜細胞數(shù)顯著少于空白對照組及陰性對照組（14.3±2.5vs.39.5±3.6&38.2±3.2）(P＜0.05)。
　　 3.細胞遷移實驗中，實驗組HGC27細胞穿膜細胞數(shù)顯著少于空白對照組及陰性對照組（21.4±2.5vs.47.3±4.5&45.7±3.5）(P＜0.05)。
　　 4.Westernblot結果顯示

13、，與空白對照組，陰性對照組比較，實驗組E-cadherin蛋白的表達上調，而vimentin，fibronectin，MMP2和MMP9蛋白的表達下降。
　　 結論:
　　 1.ZEB2表達下調可降低HGC27細胞的遷移和侵襲能力，而對HGC27細胞的增殖無明顯影響，ZEB2可能在調控胃癌發(fā)生侵襲轉移過程中起關鍵性作用。
　　 2.ZEB2表達下調可誘導E-cadherin蛋白的重新表達，抑制vimentin，f