Trop2對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　胃癌是世界五大常見腫瘤之一，其致死率位列第三[1-3]。在東亞地區(qū)，胃癌是發(fā)病率最高的癌癥之一，每年約有70％的胃癌新發(fā)病例和死亡發(fā)生在東亞、東歐和南美，而中國就占到所有人數(shù)的42％[4-6]。中國是胃癌高發(fā)國家，胃癌在中國男性人群中的發(fā)病率僅次于肺癌，位列第二，在中國女性人群中居第四位[2]。近年來，隨著人們衛(wèi)生條件的提高和飲食習(xí)慣的改善，胃癌的發(fā)病率有下降的趨勢，但是由于胃癌具有高轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)率等特點，導(dǎo)致其生

2、存預(yù)后情況差異很大，晚期胃癌的5年生存率仍低于20％。針對胃癌的傳統(tǒng)治療方法，如手術(shù)、放療、化療并未明顯改善胃癌病人的預(yù)后，因此迫切需要創(chuàng)新腫瘤治療手段。研究表明，一些基因可能對胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移具有調(diào)控作用[7]，針對這些基因的靶向治療取得了一些進(jìn)步，但是由于腫瘤形成的異質(zhì)性，多種基因間的相互作用，以及靶向藥物載體的局限等原因，導(dǎo)致胃癌的靶向治療效果不佳。因此，迫切需要尋找新的治療靶點，為胃癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入研究以及精準(zhǔn)醫(yī)療提

3、供可靠的理論依據(jù)。
　　人滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2（human trophoblast cell surface antigen2，TACSTD2/Trop2/M1S1/GA733-1），位于染色體1q32[8]。Trop2最早發(fā)現(xiàn)在人滋養(yǎng)層細(xì)胞表面[9,10]，是單跨膜蛋白，約36kDa，分為膜外區(qū)、跨膜區(qū)、膜內(nèi)區(qū)和一個磷酸化的胞質(zhì)尾[11]。Trop2能夠被腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-

4、α)轉(zhuǎn)化酶裂解為胞外域和胞內(nèi)域，胞內(nèi)域從跨膜區(qū)離開后直接進(jìn)入胞漿或核內(nèi)從而發(fā)揮生物學(xué)作用[12]。Trop2主要在上皮組織腫瘤中高表達(dá)，并能夠促進(jìn)腫瘤的惡性生物學(xué)行為[13]。本實驗室自2009開始對Trop2基因進(jìn)行研究，前期的實驗表明，Trop2基因在乳腺癌、胰腺癌、宮頸癌中高表達(dá)，但是關(guān)于Trop2基因?qū)ξ赴┑挠绊懮形匆妶蟮馈?br>　　上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)現(xiàn)

5、象是指上皮細(xì)胞在正常生理和特定病理條件下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象[14]，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]，將腫瘤細(xì)胞重新編程，使其具有干細(xì)胞特性[16-18]。為了適應(yīng)腫瘤微環(huán)境的變化，在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的早期，腫瘤細(xì)胞就會發(fā)生很多表型的改變[19]。而正常的上皮組織多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)不利于惡性腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲，腫瘤細(xì)胞為了獲得運(yùn)動能力就要通過發(fā)生EMT變化而失去上皮表型（細(xì)胞間粘附、基頂極性以及非移動性）和上皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物，如E-鈣

6、黏附蛋白(E-cadherin)，并得到間質(zhì)表型（可移動性、侵襲能力以及抗凋亡能力）和間質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志物，如纖維連接蛋白(fibronectin)、波形蛋白(vimentin)等[20-22]。因此，EMT現(xiàn)象在腫瘤轉(zhuǎn)移的早期出現(xiàn)是非常重要和必不可少的。
　　本課題首先應(yīng)用免疫組化技術(shù)，通過830例臨床胃癌組織芯片分析Trop2與臨床病理因素、預(yù)后的相關(guān)性，評價Trop2作為胃癌靶向治療分子靶點的可行性;在第二部分的研究中我們分

7、別從體內(nèi)和體外實驗探討Trop2對胃癌惡性生物學(xué)行為的影響，發(fā)現(xiàn)Trop2在胃癌上具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，抑制凋亡，并能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力;最后我們通過臨床標(biāo)本和動物實驗證實Trop2的表達(dá)和間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物vimentin的表達(dá)相關(guān)聯(lián)，進(jìn)而利用體外實驗闡明Trop2能夠介導(dǎo)β-catenin促進(jìn)vimentin的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胃癌EMT現(xiàn)象及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　研究目的：
　　1.從胃癌臨床標(biāo)本、細(xì)胞學(xué)實驗

8、和動物實驗三個層次研究Trop2對胃癌惡性生物學(xué)行為的影響和Trop2作為胃癌新靶點的可行性。
　　2.闡明Trop2可能通過調(diào)控β-catenin促進(jìn)vimentin的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胃癌EMT現(xiàn)象和侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.選擇41對胃癌組織和癌旁組織新鮮標(biāo)本，實時定量RT-PCR檢測Trop2mRNA的表達(dá)水平;用免疫組化方法檢測Trop2在830例胃癌組織芯片中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理資料分

9、析其臨床意義，探討Trop2的表達(dá)與胃癌臨床病理分期、預(yù)后等的關(guān)系。
　　2.選擇Trop2高表達(dá)和低表達(dá)各兩株胃癌細(xì)胞系，分別敲減和過表達(dá)Trop2，CCK8法和平板克隆實驗檢測胃癌細(xì)胞增殖，F(xiàn)ACS檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期，Transwell實驗檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力變化。分別選用shRNA-NC和shRNA-Trop2穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞株，制備裸鼠皮下成瘤模型，通過測量瘤體積和瘤重，比較Trop2敲減后對胃癌的抑制作用。
　

10、　3.免疫組化檢測EMT表面標(biāo)志物vimentin和Trop2在248例人胃癌組織及86例癌旁組織中的表達(dá)情況，分析兩個基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)，以及與胃癌轉(zhuǎn)移、生存預(yù)后等的相關(guān)性。
　　4.檢測過表達(dá)或敲減Trop2后胃癌細(xì)胞上EMT表面標(biāo)志物(E-cadherin，vimentin和fibronectin)及β-catenin、goocecoid、snail等EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化;TGF-β1誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株EMT模型，檢測EMT模型

11、中Trop2和EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化;免疫共沉淀實驗檢測Trop2和β-catenin間的相互作用;同時檢測Trop2，β-catenin，vimentin在胃癌細(xì)胞株，EMT模型細(xì)胞株，敲除Trop2的EMT模型細(xì)胞株上表達(dá)情況;激光共聚焦顯微鏡觀察β-catenin、vimentin在過表達(dá)/敲減Trop2胃癌細(xì)胞株、EMT模型細(xì)胞株上敲除Trop2后的表達(dá)變化情況，分析Trop2對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。
　　5.分別選用

12、shRNA-NC和shRNA-Trop2穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞株，注射裸鼠尾靜脈制備轉(zhuǎn)移瘤模型，5周后處死裸鼠，分離出肺組織，比較組別間肺組織的重量和轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量，IHC檢測肺組織轉(zhuǎn)移瘤的Trop2、ki67、vimentin表達(dá)情況，分析Trop2對胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.實時定量RT-PCR檢測41對人胃癌新鮮標(biāo)本和癌旁組織，結(jié)果顯示Trop2mRNA在胃癌組織中的表達(dá)比癌旁組織高2.32±1.44倍;免

13、疫組化檢測830例不同類型的人胃癌組織芯片，結(jié)果顯示，Trop2在胃癌組織中陽性表達(dá)率高于癌旁組織、慢性胃炎組織、低級別瘤變和高級別瘤變;胃癌中Trop2的表達(dá)與胃癌分化程度、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、幽門螺旋桿菌感染等相關(guān)，Trop2高表達(dá)預(yù)示著胃癌病人的預(yù)后不良，提示Trop2可以作為一個新的胃癌分子靶點。
　　2.細(xì)胞實驗結(jié)果顯示，Trop2能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力，并能減少胃癌細(xì)胞的凋亡數(shù)量

14、;過表達(dá)Trop2后，胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力增強(qiáng)，敲減Trop2能抑制胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力;Trop2促進(jìn)胃癌細(xì)胞周期中S期所占比例明顯增多。動物實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲減Trop2在體內(nèi)能明顯抑制腫瘤的增殖能力，抑瘤率達(dá)到50.40％。免疫組化結(jié)果顯示，和空載對照組的腫瘤組織相比，shRNA-Trop2組的腫瘤組織中Trop2表達(dá)量相對較低。結(jié)果提示Trop2對胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為具有促進(jìn)作用。
　　3.免疫組化檢測248例胃

15、癌組織及86例癌旁組織中Trop2和vimentin的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Trop2和vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)，Trop2和vimentin在胃癌組織中陽性表達(dá)率高于癌旁組織;胃癌組織中Trop2+/vimentin+表達(dá)和分化、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等相關(guān)，Trop2+/vimentin+預(yù)示著胃癌病人的預(yù)后不良，提示胃癌中Trop2的表達(dá)可能和胃癌EMT現(xiàn)象有關(guān)。
　　4.細(xì)胞水平實驗結(jié)果顯示，western-blot和實

16、時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，Trop2可上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞表型vimentin和fibronectin，下調(diào)上皮細(xì)胞表型E-cadherin，同時上調(diào)EMT調(diào)控因子β-catenin; TGF-β1能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系發(fā)生EMT現(xiàn)象，誘導(dǎo)7天后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，免疫熒光和實時定量RT-PCR結(jié)果顯示細(xì)胞E-cadherin表達(dá)量減少，vimentin和fibronectin表達(dá)量增加，證實EMT模型誘導(dǎo)成功;EMT模型組細(xì)胞Trop2表

17、達(dá)明顯增加，同時上調(diào)EMT調(diào)控因子β-catenin;免疫共沉淀實驗推測Trop2和β-catenin可在胞內(nèi)發(fā)生結(jié)合;Western-blot實驗結(jié)果顯示Trop2能通過上調(diào)β-catenin促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT現(xiàn)象;激光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步觀察到Trop2能通過促進(jìn)β-catenin核內(nèi)聚集，上調(diào)EMT表面標(biāo)志物vimentin的表達(dá)。提示Trop2能通過上調(diào)p-catenin促進(jìn)vimentin表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)胃癌EMT和侵襲轉(zhuǎn)移的

18、分子機(jī)制。
　　5.在體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型中，敲減Trop2的胃癌細(xì)胞經(jīng)裸鼠尾靜脈注射后，肺部轉(zhuǎn)移瘤形成數(shù)量少于空載對照組;肺部轉(zhuǎn)移瘤組織的免疫組化結(jié)果顯示，Trop2敲減組的Trop2、vimentin和Ki67的表達(dá)量明顯少于空載對照組。
　　研究結(jié)論：
　　1.Trop2在胃癌組織高表達(dá)，其高表達(dá)與胃癌分化、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和幽門螺旋桿菌感染有關(guān)，并預(yù)示著胃癌病人的預(yù)后不良，提示Trop2可作為

19、治療胃癌的分子靶點。
　　2.Trop2高表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，抑制凋亡，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，以及細(xì)胞的有絲分裂能力。
　　3.Trop2和vimentin在胃癌組織上共同高表達(dá)，并呈正相關(guān);胃癌組織中Trop2+/vimentin+表達(dá)和分化、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等相關(guān)，Trop2+/vimentin+預(yù)示著胃癌病人的預(yù)后不良，提示胃癌中Trop2的表達(dá)可能和胃癌EMT現(xiàn)象有關(guān)。
　　4.Trop2能通