TROP2對(duì)宮頸癌生物學(xué)行為的影響及Anti-TROP2-HGNs近紅外熱療對(duì)宮頸癌作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 TROP2在宮頸癌中的表達(dá)及與Ki-67的相關(guān)性研究
　　目的:
　　檢測(cè)并分析TROP2在宮頸病變組織中的表達(dá)，探討TROP2的表達(dá)在宮頸癌細(xì)胞增殖中的作用及與患者臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)性。
　　方法:
　　采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)20例正常宮頸組織、34例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、106例宮頸癌中TROP2及Ki-67蛋白的表達(dá);卡方檢驗(yàn)分析TROP2表

2、達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性;Spearman檢驗(yàn)法分析TROP2和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性;單因素和多因素Cox回歸分析宮頸癌患者預(yù)后的影響因素;Kaplan-Meier法繪制患者的生存曲線;Log-rank檢驗(yàn)分析比較患者的總體生存率和無(wú)進(jìn)展生存率的差別。
　　結(jié)果:
　　1.TROP2主要表達(dá)于病變宮頸組織的細(xì)胞膜。在正常宮頸組織中，8例(40％)呈弱陽(yáng)性表達(dá)，1例(5％)中等陽(yáng)性，無(wú)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。TROP2在CIN組中的

3、表達(dá)率呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，其中CINⅠ陽(yáng)性率為50％，CINⅡ陽(yáng)性率為66.7％，CINⅢ陽(yáng)性率為76.9％，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.037)。宮頸癌組織中TROP2表達(dá)率最高，為88.7％，明顯高于CIN和正常宮頸組織，三者比較，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。
　　2.TROP2的表達(dá)與宮頸癌組織學(xué)分化程度、FIGO臨床分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，而與宮頸癌患者年齡(p=0.1)及腫瘤直徑(P=0.255)無(wú)明顯相

4、關(guān)性。
　　3.Ki-67在正常宮頸組織、CIN、宮頸癌中的表達(dá)陽(yáng)性率逐漸升高，陽(yáng)性率依次為25％(5/20)，55.9％(19/34)，79.2％(84/106)，三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。相關(guān)性Spearman相關(guān)分析顯示，TROP2和Ki-67在宮頸癌組織中的表達(dá)具有顯著相關(guān)性(r=0.440，p＜0.001)。
　　4.TROP2高表達(dá)病人與低表達(dá)病人相比，表現(xiàn)出更低的OS和PFS。應(yīng)用多因素Cox回歸

5、分析，結(jié)果顯示，TROP2蛋白表達(dá)水平、組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立因素。
　　結(jié)論:
　　1.TROP2在正常宮頸組織、CIN組織、宮頸癌組織中表達(dá)量逐漸升高，且TROP2的高表達(dá)與宮頸癌的不良臨床病理特征相關(guān)，說(shuō)明TROP2參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。
　　2.TROP2與Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)，說(shuō)明TROP2可能參與了宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖過(guò)程。
　　3.TROP2的高表達(dá)影響宮頸癌患者的

6、預(yù)后，是評(píng)價(jià)宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立因素。
　　第二部分 TROP2的表達(dá)對(duì)宮頸癌生物學(xué)行為的影響及相關(guān)機(jī)制研究
　　目的:
　　探討TROP2的表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、凋亡、周期、侵襲轉(zhuǎn)移及化療耐藥等能力的影響，探討TROP2在宮頸癌發(fā)病中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　通過(guò)siRNA干擾沉默宮頸癌Siha和CaSki細(xì)胞中TROP2的表達(dá)，pcDNA3.1TROP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)HeLa和C33A細(xì)胞中TROP

7、2的表達(dá)。Western blot技術(shù)檢測(cè)并確認(rèn)干擾效率之后，CCK8法檢測(cè)TROP2表達(dá)水平的改變對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室測(cè)定細(xì)胞遷移及侵襲能力;Western blot檢測(cè)凋亡、周期、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的變化及與ERK/MAPK信號(hào)通路的相關(guān)性;應(yīng)用不同濃度的順鉑作用于TROP2基因沉默后的Siha和CaSki細(xì)胞，CCK

8、-8法繪制細(xì)胞生存曲線，比較IC50，并分析化療耐藥與TROP2的表達(dá)及ERK1/2信號(hào)通路的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.Western blot檢測(cè)TROP2在Siha，HeLa，CaSki和C33A細(xì)胞中均有表達(dá)，設(shè)計(jì)并合成的siRNA-1100和siRNA-550序列均能有效地減少TROP2的表達(dá)，干擾效率在70％以上;真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1 TROP2轉(zhuǎn)染之后，TROP2蛋白表達(dá)量明顯升高，確定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成功。

9、
　　2.CCK-8法研究發(fā)現(xiàn)，TROP2基因沉默的Siha和CaSki細(xì)胞增殖能力明細(xì)下降(p＜0.05)，而過(guò)表達(dá)TROP2的HeLa和C33A細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后2-4天增殖能力明顯增加(p＜0.05)。
　　3.AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)TROP2基因表達(dá)沉默之后，Siha和CaSki細(xì)胞早期和晚期凋亡率明顯升高，總凋亡率也顯著提高(p＜0.05)。相反，HeLa和C33A細(xì)胞在T

10、ROP2表達(dá)上調(diào)之后早期凋亡、晚期凋亡率及總凋亡率均明顯下降(p＜0.05)。TROP2基因沉默后的Siha和CaSki細(xì)胞Bcl-2表達(dá)顯著降低，而B(niǎo)ax表達(dá)量上升。而TROP2過(guò)表達(dá)的HeLa和C33A細(xì)胞，Bcl-2表達(dá)上調(diào)而B(niǎo)ax表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.TROP2參與了宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為，干擾其表達(dá)提高了對(duì)順鉑的敏感性。說(shuō)明TROP2在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用，并對(duì)

11、宮頸癌靶向治療提供理論依據(jù)。
　　2.TROP2在宮頸癌細(xì)胞中與ERK/MAPK信號(hào)通路存在關(guān)聯(lián)，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、化療耐藥等惡性生物學(xué)行為。
　　第三部分 Anti-TROP2/空心納米金球近紅外熱療對(duì)宮頸癌細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:
　　研制合成具有腫瘤細(xì)胞靶向作用的空心納米金顆粒，評(píng)價(jià)HGNs及anti-TROP2/HGNs近紅外熱療對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及殺傷作用，進(jìn)一步揭示納米材料聯(lián)

12、合近紅外熱療對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制。
　　方法:
　　采用濕化學(xué)法，首先制備合成納米銀粒子，然后以此為模板，加入氯金酸還原得到HGNs。用異官能團(tuán)的聚已二醇SH-PEG-COOH作為連接劑將HGNs與anti-TROP2抗體共價(jià)鍵偶聯(lián)，HGNs與mPEG-SH孵育形成mPEG/HGNs作為對(duì)照。通過(guò)透射電鏡，紫外分光光度計(jì)等對(duì)合成的納米粒子進(jìn)行表征。通過(guò)CCK-8的方法檢測(cè)HGNs對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的毒性。倒置顯微鏡及TEM

13、觀察納米金粒子在HeLa細(xì)胞內(nèi)的分布及攝取情況。CCK-8方法檢測(cè)在不同功率的近紅外激光照射下，mPEG/HGNs及anti-TROP2/HGNs對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的程度。光鏡下觀察HeLa細(xì)胞經(jīng)過(guò)光熱治療后的形態(tài)變化。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。Hoechst進(jìn)行凋亡染色分析。Western blot方法檢測(cè)光熱治療后bcl-2和bax的表達(dá)變化。共聚焦顯微鏡觀察γ-H2AX的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.合成的HGN

14、s形態(tài)規(guī)則，呈中空的圓球形，大小均一，分散良好，均勻分布。HGNs的粒徑為51.6±7 nm，厚度為4.67±1.52 nm，紫外吸收光譜可見(jiàn)在780nm處有明顯的等離子共振吸收峰。利用異官能團(tuán)的聚已二醇SH-PEG-COOH將HGNs與anti-TROP2抗體共價(jià)鍵連接，TEM照片顯示，偶聯(lián)上抗體的HGNs仍保持中空的圓球形形態(tài)，分布均勻，分散性良好，未見(jiàn)顆粒間明顯團(tuán)聚粘連。疏水粒徑較HGNs有所增加，紫外吸收光譜可見(jiàn)最大吸收峰位置紅

15、移，從780nm移動(dòng)到818 nm左右。
　　2.將濃度為0.3nM，1nM，2nM和3nM的HGNs作用于宮頸癌HeLa細(xì)胞3-48h，CCK8結(jié)果顯示HGNs未表現(xiàn)出明顯的毒性。
　　3.倒置顯微鏡下觀察HGNs與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)1小時(shí)后即能進(jìn)入細(xì)胞，投射電鏡下觀察到明顯的膜樣結(jié)構(gòu)的吞噬泡形成。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)成功制備了空心納米金球，共價(jià)鍵連接anti-TROP2抗體，細(xì)胞攝取anti-TROP