瘦素對胃癌細胞侵襲和遷移的影響及機制研究.pdf

1、第一部分瘦素對胃癌細胞侵襲的影響及機制研究
　　 研究背景:
　　 胃癌死亡率居世界第二位，導(dǎo)致胃癌高死亡率的原因主要與晚期發(fā)生的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，及時捕捉預(yù)警信號并闡明腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機制，對于胃癌的防治至關(guān)重要。研究表明多種因素參與此過程，其中肥胖易致癌癥，是胃癌的風(fēng)險因子之一。瘦素(Leptin)主要由脂肪細胞分泌，是重要的脂肪因子之一，參與多種癌癥的發(fā)生。胃癌時瘦素水平升高，通過自分泌或旁分泌途徑在胃癌發(fā)生發(fā)展

2、中發(fā)揮重要作用，但是其確切影響和具體調(diào)節(jié)機制尚不清楚。
　　 腫瘤細胞通過合成大量基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMPs)降解細胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)，是腫瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一。膜基質(zhì)金屬蛋白酶-1(Membrane-type1 matrix metalloproteinases，MT1-MMP)作為多種蛋白酶的“總開關(guān)”，除了能直接降解ECM

3、，還可激活多種酶底物，間接降解ECM中的多種成分，發(fā)揮其促腫瘤侵襲作用。MT1-MMP與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但作為膜型分子，其發(fā)揮作用的前提是胞內(nèi)生成及轉(zhuǎn)運至細胞膜上，因而該階段或許存在可對其活性進行早期干預(yù)的多種潛在靶點。近來有研究證實，瘦素可分別調(diào)控MMP-2、MMP-7和MMP-13在乳腺癌及膠質(zhì)瘤中的表達，進而促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。但瘦素對胃癌細胞MT1-MMP的調(diào)節(jié)及其在侵襲中的作用，迄今未見報道。
　　 綜上所述，基

4、于本領(lǐng)域國內(nèi)外研究進展及課題組的前期研究基礎(chǔ)，我們體外觀察瘦素對胃癌細胞MT1-MMP表達和侵襲的影響，探討瘦素受體下游信號傳導(dǎo)分子Akt、ERK1/2、STAT3介導(dǎo)驅(qū)動蛋白KIFs對MT1-MMP膜表達的作用，同時收集胃癌和匹配的癌旁組織標本，檢測上述分子的表達，并分析其與臨床參數(shù)的關(guān)系。本研究將進一步闡明胃癌侵襲轉(zhuǎn)移機制，同時也為早期控制胃癌提供潛在治療靶點。
　　 研究目的:
　　 1.觀察瘦素對胃癌細胞侵襲及M

5、T1-MMP表達的調(diào)節(jié)。
　　 2.分析驅(qū)動蛋白1B(KIF1B)在瘦素調(diào)節(jié)胃癌細胞中MT1-MMP表達中的作用及對胃癌細胞侵襲的影響。
　　 3.闡明胃癌細胞中瘦素受體下游信號途徑在調(diào)節(jié)MT1-MMP生成及KIF1B調(diào)節(jié)MT1-MMP膜表達中的作用。
　　 4.檢測胃癌及癌旁組織中瘦素、KIF1B、MT1-MMP表達，并分析三種分子之間的關(guān)系及其與臨床參數(shù)的關(guān)系。
　　 研究方法:
　　 1.瘦

6、素對胃癌細胞侵襲的影響
　　 胃癌細胞(AGS)與不同濃度瘦素(0、50、100、250、500 ng/ml)和瘦素抗體37℃培養(yǎng)24小時后，Transwell檢測胃癌細胞侵襲改變，確定最佳瘦素作用濃度。胃癌細胞(AGS、MKN-45、MKN-28)分為未處理組(Control)、瘦素(Leptin)、瘦素抗體(Anti-leptin)、瘦素+瘦素抗體(Leptin+Anti-leptin)組，37℃培養(yǎng)24小時后，Transw

7、ell檢測胃癌細胞侵襲，膠原酶侵襲實驗檢測瘦素對胃癌細胞侵襲的影響。
　　 2.瘦素對胃癌細胞中MT1-MMP生成的影響
　　 胃癌AGS細胞分為Control、Leptin、Anti-leptin、Leptin+Anti-leptin組，37℃培養(yǎng)24小時后，RT-PCR檢測MT1-MMP基因表達變化，Western Blot檢測MT1-MMP蛋白表達變化，流式細胞術(shù)和細胞表面生物素化技術(shù)檢測膜表面MT1-MMP表達，

8、分析瘦素對MT1-MMP表達的影響。同時明膠酶譜檢測胃癌細胞培養(yǎng)上清中MMP-2表達。
　　 3.檢測瘦素作用后胃癌細胞表達變化的KIFs分子，觀察其在瘦素調(diào)節(jié)MT1-MMP表達中的作用及在胃癌細胞侵襲中的作用
　　 胃癌AGS細胞分為Control、Leptin、Anti-leptin、Leptin+Anti-leptin組，RT-PCR檢測KIFs基因水平表達變化，篩選表達變化的KIFs分子，然后Western Bl

9、ot檢測其蛋白水平表達變化。
　　 siRNA沉默相應(yīng)KIFs分子，胃癌細胞分為Control、Con-siRNA、KIFs-siRNA、Leptin、Leptin+Con-siRNA、Leptin+KIFs-siRNA組，37℃培養(yǎng)24小時后，RT-PCR檢測MT1-MMP基因表達變化，Western Blot檢測MT1-MMP蛋白表達變化，流式細胞術(shù)和細胞表面生物素化技術(shù)檢測膜表面MT1-MMP表達。胃癌細胞分為Contro

10、、 Leptin、KIF1B-siRNA、MT1-MMP-siRNA、Leptin+KIF1B-siRNA、Leptin+MT1-MMP-siRNA組、Leptin+KIF1B-siRNA+MT1-MMP-siRNA組，37℃培養(yǎng)24小時后Transwell檢測胃癌細胞侵襲變化。
　　 4.瘦素對KIFs和MT1-MMP相互作用的影響
　　 免疫共沉淀分析與MT1-MMP相互作用的KIFs分子。構(gòu)建人MT1-MMP真核表

11、達載體(pcDNA3.1-MT1-MMP)，然后轉(zhuǎn)染胃癌細胞。瘦素作用后不同時間（0、6、12、24、48小時），免疫共沉淀檢測瘦素對KIF1B和MT1-MMP相互作用的影響。
　　 5.瘦素受體下游信號傳導(dǎo)分子AKT、ERK1/2、STAT3在瘦素介導(dǎo)KIFs調(diào)節(jié)MT1-MMP表達中的作用
　　 瘦素作用胃癌AGS細胞不同時間（0，15，30，60分鐘）后，Western blot檢測不同信號通路蛋白(STAT3、P-

12、STAT3、AKT、P-AKT、ERK1/2、P-ERK1/2)的表達變化。
　　 胃癌AGS細胞分為Control、Leptin、LY294002（p-AKT抑制劑）、U0126（p-ERK1/2抑制劑）、CucurbitacinⅠ（p-STAT3抑制劑）、Leptin+LY294002、Leptin+U0126、Leptin+CucurbitacinⅠ組，Western Blot分別檢測目的KIFs分子、MT1-MMP蛋白表

13、達水平變化，細胞表面生物素化技術(shù)檢測膜表面MT1-MMP表達變化。
　　 6.檢測胃癌組織瘦素、MT1-MMP和KIFs表達，并分析三個分子相關(guān)性及與臨床參數(shù)關(guān)系
　　 從山東大學(xué)齊魯醫(yī)院收集胃癌及癌旁組織86例，免疫組化和Western blot檢測組織中瘦素、KIF1B、MT1-MMP表達，并分析三種分子之間的關(guān)系及其與臨床參數(shù)的關(guān)系。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.瘦素促進胃癌細胞侵襲
　　

14、體外實驗表明，瘦素(0、50、100、250、500 ng/ml)能夠以劑量依賴方式促進胃癌細胞侵襲，而瘦素抗體（10μg/ml）能夠拮抗瘦素的促侵襲作用。而瘦素（100 ng/ml）能夠顯著誘導(dǎo)胃癌細胞侵襲(AGS(3.81±0.39倍，P=0.006)＞MKN-45(2.76±0.23倍，P=0.005)＞MKN-28(1.83±0.18倍，P=0.016)。同時瘦素(100 ng/ml)也促進胃癌細胞膠原酶侵襲。
　　 2

15、.瘦素促進MT1-MMP膜表達，進而促進胃癌細胞侵襲
　　 瘦素(100 ng/ml)促進胃癌細胞MT1-MMP基因（3.01±0.48倍，P=0.010）及蛋白(3.77±0.99倍，P=0.009)表達，同時促進膜表面MT1-MMP(2.36±0.27倍，P=0.013)表達，流式細胞術(shù)結(jié)果也表明膜MT1-MMP表達上調(diào)(2.13±0.17倍，P=0.008)，而瘦素抗體則抑制此過程。同時瘦素也上調(diào)胃癌細胞MMP-2表達(A

16、GS:1.73±0.1倍，P=0.006; MKN-45:1.55±0.09倍，P=0.008; MKN-28:1.33±0.07倍，P=0.013)。
　　 3.瘦素通過上調(diào)KIF1B促進MT1-MMP膜表達，進而促進胃癌侵襲
　　 RT-PCR結(jié)果表明瘦素(100 ng/ml)作用后胃癌細胞KIF3A、KIF3B、KIF5B表達無顯著變化（P＞0.05），而KIF1B則在基因（3.34±0.12倍，P=0.007）及

17、蛋白（3.52±0.18倍，P=0.002）水平表達上調(diào)，瘦素抗體則拮抗此過程。利用KIF1B-siRNA干擾掉KIF1B后，發(fā)現(xiàn)并不影響瘦素對MT1-MMP基因（P＞0.05）及蛋白（P＞0.05）水平的上調(diào)作用，但是能夠降低瘦素對膜表面MT1-MMP的上調(diào)作用（48.1％±4.0％，P=0.003）。瘦素誘導(dǎo)的胃癌細胞侵襲被MT1-MMP-siRNA（62.8％±4.5％，P=0.005）和KIF1B-siRNA(45.2％±6.5

18、％，P=0.016)降低，二者聯(lián)合降低71.1％±3.7％（P＜0.001）。
　　 4.瘦素對KIF1B和MT1-MMP相互作用的影響
　　 免疫共沉淀結(jié)果發(fā)現(xiàn)KIF1B和MT1-MMP存在相互作用，且瘦素顯著促進二者的相互作用，6小時作用不顯著（P＞0.05），從12小時開始增加。瘦素作用48小時后MT1-MMP表達高KIF1B，表明瘦素能夠促進KIF1B對MT1-MMP的轉(zhuǎn)運作用。
　　 5.瘦素受體下游A

19、TK途徑參與KIF1B及MT1-MMP表達的調(diào)節(jié)
　　 瘦素能夠活化瘦素受體下游三個信號通路STAT3、ERK1/2和AKT，分別在15、30、30分鐘活化達到高峰，利用通路抑制劑發(fā)現(xiàn)cucurbitacinⅠ（STAT3抑制劑）并不影響KIF1B和MT1-MMP及膜MT1-MMP表達，而LY294002(AKT抑制劑)能夠降低瘦素誘導(dǎo)的MT1-MMP（84.7％±6.8％，P=0.005）、KIF1B（81.5％±8.5％，P

20、=0.012）和膜MT1-MMP（76.0％±8.9％，P=0.01）的表達作用，U0126（ERK1/2抑制劑）則部分抑制瘦素誘導(dǎo)的MT1-MMP（53.4％±5.6％，P=0.003）、KIF1B（47.6％±4.9％，P=0.011）的表達作用，但對膜MT1-MMP表達無顯著作用，表明AKT參與KIF1B依賴的MT1-MMP膜轉(zhuǎn)運過程。
　　 6.胃癌組織高表達瘦素、MT1-MMP和KIF1B三者表達顯著相關(guān)，且與臨床分期

21、、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)
　　 免疫組化結(jié)果表明與癌旁組織相比，胃癌組織高表達瘦素(59.3％，51/86)、MT1-MMP(63.9％，55/86)和KIF1B(68.6％，59/86)，三者表達顯著相關(guān)（Leptin和MT1-MMP: P＜0.001; Leptin和KIF1B: P=0.039; MT1-MMP和KIF1B:P＜0.001），且分別于胃癌分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，表明在體內(nèi)三個分子存在潛在的相互調(diào)節(jié)關(guān)系。
　　 結(jié)

22、論:
　　 1.瘦素是MT1-MMP有效的胞內(nèi)活化劑，瘦素通過上調(diào)MT1-MMP促進胃癌細胞侵襲。
　　 2.瘦素促進胃癌細胞MT1-MMP膜表達過程是KIF1B依賴的，參與胃癌細胞侵襲過程。
　　 3.闡明瘦素受體下游AKT信號途徑在瘦素促進MT1-MMP膜表達的作用，為早期控制胃癌侵襲提供潛在診斷、治療策略及數(shù)據(jù)支持。
　　 意義
　　 通過本課題的研究，明確瘦素對MT1-MMP表達的調(diào)控機制

23、及其在胃癌侵襲中的作用，從而進一步明確胃癌侵襲機制，同時也為早期控制胃癌MT1-MMP活性及侵襲提供潛在的治療靶點。
　　 第二部分瘦素對胃癌細胞遷移的影響及機制研究
　　 研究背景:
　　 胃癌是世界第二大癌癥，死亡率居世界前列，脂肪細胞為腫瘤細胞快速生長提供能量，脂肪代謝紊亂能夠?qū)е挛赴┑陌l(fā)生，因此肥胖是胃癌的危險因子之一。瘦素主要由脂肪細胞分泌，能夠與瘦素受體結(jié)合后通過調(diào)節(jié)飲食攝入和能量代謝參與體內(nèi)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)

24、態(tài)的平衡維持。最近研究表明瘦素也參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，本研究前期研究結(jié)果表明胃癌組織瘦素過表達，且與胃癌侵襲和遷移密切相關(guān)，但具體的作用及機制尚不清楚。ICAM-1分子是免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，介導(dǎo)細胞-細胞以及細胞-細胞外基質(zhì)的相互作用。ICAM-1分子可以在腫瘤細胞侵襲周圍組織過程中發(fā)揮作用，在多種腫瘤如前列腺癌、肺癌時表達上調(diào)，且參與腫瘤遷移過程。且胃幽門螺旋桿菌感染后瘦素和ICAM-1分子表達均上調(diào)，表明二者可能具有潛在的調(diào)

25、節(jié)作用，但是確切的作用及機制尚不清楚。
　　 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)瘦素能夠通過上調(diào)MT1-MMP表達促進胃癌細胞侵襲，而已有的研究也發(fā)現(xiàn)MT1-MMP能夠剪切ICAM-1分子促進腫瘤細胞遷移，但是瘦素對ICAM-1的具體作用及其在胃癌遷移中的作用尚未闡明。綜上所述，基于本領(lǐng)域國內(nèi)外研究進展及課題組的前期研究基礎(chǔ)，我們收集胃癌組織標本，檢測瘦素和ICAM-1的表達，并分析其與臨床參數(shù)的關(guān)系。然后體外觀察瘦素對胃癌細胞ICAM-1表

26、達的影響，探討ICAM-1在胃癌細胞遷移中的作用。最后觀察信號途徑Rho/ROCK在瘦素對ICAM-1表達調(diào)節(jié)中的作用。本研究將進一步闡明胃癌轉(zhuǎn)移機制，同時也為早期控制胃癌提供潛在治療靶點。
　　 研究目的:
　　 1.檢測胃癌組織中瘦素、ICAM-1表達，并分析二者之間的關(guān)系及其與臨床參數(shù)的關(guān)系。
　　 2.觀察瘦素對胃癌細胞遷移的影響。
　　 3.觀察瘦素對胃癌細胞ICAM-1表達的影響，探討其在瘦素

27、調(diào)節(jié)胃癌細胞遷移中的的作用。
　　 4.闡明胃癌細胞中信號途徑Rho/RPCK在瘦素調(diào)節(jié)ICAM-1表達中的作用。
　　 研究方法:
　　 1.檢測胃癌組織瘦素和ICAM-1表達，分析二者相關(guān)性及與臨床參數(shù)關(guān)系
　　 從山東大學(xué)齊魯醫(yī)院收集石蠟包埋的胃癌組織84例，免疫組化檢測組織中瘦素和ICAM-1分子的表達，進一步分析二者的相關(guān)性及其與臨床參數(shù)的關(guān)系。
　　 2.瘦素對胃癌細胞遷移的影響

28、>　　 體外實驗利用胃癌細胞系A(chǔ)GS和MKN-45，transwell檢測不同劑量瘦素(0、50、100、250、500 ng/ml)37℃作用后不同時間（0、6、12、24、36小時）胃癌細胞遷移變化，計算侵襲指數(shù)，確定最佳瘦素作用濃度。
　　 3.瘦素對胃癌細胞中ICAM-1表達的影響，觀察其在瘦素調(diào)節(jié)胃癌細胞遷移中的作用
　　 胃癌細胞（AGS和MKN-45）分為未處理組（Control）、瘦素(Leptin，1

29、00ng/ml)組，37℃培養(yǎng)24小時后，RT-PCR和western blot檢測ICAM-1基因及蛋白水平表達，流式細胞術(shù)檢測胃癌細胞膜表面ICAM-1表達，ELISA檢測胃癌細胞培養(yǎng)上清中可溶性ICAM-1表達。
　　 利用ICAM-1-siRNA技術(shù)沉默ICAM-1，胃癌細胞分為Control、Leptin+con-siRNA、Leptin+ICAM-1-siRNA組，37℃培養(yǎng)24小時后Transwell檢測胃癌細胞遷

30、移變化。
　　 4.信號途徑Rho/ROCK在瘦素調(diào)節(jié)ICAM-1表達中的作用
　　 瘦素作用胃癌細胞不同時間（0、15、30、60分鐘）后，G-LISA RhoA活化檢測試劑盒檢測RhoA GTPase活性，western blot檢測胃癌細胞P-ROCK和ROCK表達。
　　 胃癌細胞分為Control、Leptin、C3 transferase(RhoA抑制劑)、Y-27632(ROCK通路抑制劑)、Lep

31、tin+C3 transferase、Leptin+Y-27632組，37℃培養(yǎng)24小時后。RT-PCR和western blot檢測ICAM-1基因及蛋白水平表達，流式細胞術(shù)檢測胃癌細胞膜表面ICAM-1表達，ELISA檢測胃癌細胞培養(yǎng)上清中可溶性ICAM-1表達。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.胃癌組織高表達瘦素和ICAM-1，二者表達顯著相關(guān)，且與臨床分期、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)
　　 免疫組化分析顯示胃癌組織過表達瘦

32、素(48/84，57.1％)和ICAM-1(54/84，64.2％)，二者表達顯著正相關(guān)(P＜0.001)，且分別與臨床分期及遷移緊密相關(guān)。表明在體內(nèi)二個分子存在潛在的相互調(diào)節(jié)關(guān)系。
　　 2.瘦素促進胃癌細胞遷移
　　 體外實驗表明，瘦素（0、50、100、250、500 ng/ml）能夠以時間和劑量依賴方式促進胃癌細胞(AGS和MKN-45)遷移。
　　 3.瘦素通過上調(diào)ICAM-1表達促進胃癌細胞遷移

33、>　　 結(jié)果表明瘦素(100 ng/ml)通過上調(diào)胃癌細胞ICAM-1基因（AGS:4.06±0.54倍，P＜0.001; MKN-45:2.56±0.33倍，P=0.005）及蛋白(AGS:3.07±0.25倍，P＜0.001; MKN-45:2.9±0.26倍，P=0.003)表達，另外，瘦素也上調(diào)胃癌細胞表面ICAM-1（AGS:從43.65％±2.42％到78.96％±2.09％，P＜0.01;MKN-45:從35.35％±1

34、.61％到59.64％±3.51％，P＜0.001）和可溶性ICAM-1表達(AGS，P＜0.05; MKN-45, P＜0.01)。
　　 利用ICAM-1-siRNA干擾掉ICAM-1后，瘦素誘導(dǎo)的胃癌細胞遷移作用被ICAM-1-siRNA抑制(AGS:53.9％±3.6％,P=0.020; MKN-45:42.79％±3.78％,P=0.005)。
　　 4.信號途徑Rho/ROCK參與瘦素調(diào)節(jié)ICAM-1表達

35、r>　　 瘦素在15分鐘（AGS:1.2±0.2倍;MKN-45:1.1±0.1倍）、30分鐘(AGS:1.6±0.1倍;MKN-45:1.36±0.06倍)和60分鐘（AGS:1.67±0.12倍;MKN-45:1.5±0.1倍）能夠促進胃癌細胞RhoA活性。ROCK的磷酸化水平也在15、30、60分鐘升高。
　　 利用通路抑制劑C3 transferase（Rho抑制劑，0.25μg/ml）和Y-27632(ROCK抑制劑

36、，3.3μM)，發(fā)現(xiàn)瘦素通過Rho/ROCK途徑上調(diào)ICAM-1蛋白表達，同時增強膜表面ICAM-1及可溶性ICAM-1表達，C3 transferase和Y-27632抑制瘦素促進ICAM-1、膜表面ICAM-1、可溶性ICAM-1表達（AGS，P＜0.01;MKN-45，P＜0.01）。
　　 結(jié)論:
　　 1.瘦素是ICAM-1有效的胞內(nèi)活化劑，瘦素通過上調(diào)ICAM-1表達促進胃癌細胞遷移。
　　 2.闡明