糖皮質(zhì)激素對卵巢癌細胞遷移和侵襲的影響及其機制研究.pdf

1、目的:
　　轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特點之一，也是造成腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移過程極其復(fù)雜，包括腫瘤細胞從原位腫瘤脫落，脫落的腫瘤細胞與基質(zhì)黏附、釋放基質(zhì)水解酶破壞和穿過基底膜，侵襲血管和淋巴管，進入循環(huán)并最終達到轉(zhuǎn)移部位，在新的部位定居并增殖。細胞的遷移運動能力和侵襲能力是決定腫瘤轉(zhuǎn)移能力的重要因素。腫瘤的遷移涉及細胞骨架和形態(tài)的改變、細胞的粘附和運動，期間參與調(diào)控的有多種生長因子、細胞粘附分子、與細胞運動有關(guān)的小G蛋白（如小G

2、蛋白Rho亞家族的成員RhoA，RhoB和RhoC），骨架調(diào)節(jié)蛋白和趨化因子等。而腫瘤細胞的侵襲能力除了與其增殖和運動遷移能力有關(guān)外，還與其降解細胞外基質(zhì)的能力，如分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)以及一些蛋白酶的激活物，如尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)等有關(guān)。近年來的研究已證明腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移潛力還依賴于腫瘤的微環(huán)境。由于腫瘤轉(zhuǎn)移過程極其復(fù)雜，參與調(diào)控的因素很多，其機制目前仍不很清楚。
　　最新的臨床資料研究，流行病學(xué)研究和動物模型

3、為基礎(chǔ)的研究均提示慢性應(yīng)激影響腫瘤的進展，因此由于應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)內(nèi)分泌改變對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響近年來很受關(guān)注。已有一些研究表明交感和腎上腺素系統(tǒng)直接有促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的作用。糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)是體內(nèi)另一個重要應(yīng)激激素，在軀體和心理應(yīng)激時血漿中GC明顯增高。此外，人工合成的GC，如地塞米松(Dex)被臨床廣泛用于治療免疫與炎癥性疾?。ㄈ缂t斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎），以及作為重要的輔助藥物用于減輕因腫瘤化療治療

4、帶來的不良反應(yīng)（如過敏，惡心嘔吐等），這些也可導(dǎo)致體內(nèi)GC水平的增高。GC的作用通過糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)介導(dǎo)。作為激素依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，激活的GR以二聚體的形式與靶基因啟動子中的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(glucocorticoid response element，GRE)結(jié)合，直接地調(diào)節(jié)（促進或者抑制）基因表達，或者通過與其他轉(zhuǎn)錄因子（如NF-κB和AP-1等）相互作用而間接地調(diào)節(jié)基因表達

5、，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。近年來的國外和我們的研究都表明GC還可影響細胞內(nèi)多種信號分子的表達和活性，并在細胞內(nèi)的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。目前認為GC對實體腫瘤的作用主要通過其對免疫系統(tǒng)的作用，即通過其強大的免疫抑制作用，促進腫瘤細胞的免疫逃逸，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。迄今GC對腫瘤細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的研究十分有限，而且已報道的結(jié)果因腫瘤細胞的類型以及所用的腫瘤模型不同而各異，既有促進作用，也有抑制作用，至今不明確，其作用機制也不清楚，因

6、此這方面有進一步研究的必要。
　　卵巢癌是婦科致死率最高的腫瘤。大于70％的卵巢癌在發(fā)現(xiàn)時就已是晚期，伴有盆腹腔或遠處轉(zhuǎn)移。但目前對于卵巢癌轉(zhuǎn)移的機制還不清楚，因此研究卵巢癌的轉(zhuǎn)移十分必要。已有的研究表明卵巢癌組織中GR的陽性率高達88％，比ER和PR都高，表明GC/GR信號通路在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展中起著十分重要的作用。國外和我們實驗室的研究發(fā)現(xiàn)GC能輕度抑制卵巢癌細胞的增殖，增強卵巢癌細胞與細胞外基質(zhì)的粘附，改變多種與細胞存活和

7、凋亡相關(guān)的信號通路促進化療藥作用下卵巢癌細胞的存活。有研究表明遠處轉(zhuǎn)移的卵巢癌組織中GR的靶基因糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白(GILZ)高表達，且高表達的GILZ能激活PI3K/AKT的通路，促進卵巢癌的增殖和侵襲，這強烈提示GC與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。既往的研究也證實作為應(yīng)激激素之一的GC對卵巢癌細胞侵襲有促進也有抑制作用。是否與卵巢癌細胞的來源和侵襲性的不同而有差異還不很清楚，有進一步研究的必要。因此本課題研究了GC在體外和體

8、內(nèi)對卵巢癌細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，并在此基礎(chǔ)上進一步探討了GC促進卵巢癌細胞遷移侵襲的機制。
　　方法:
　　我們在卵巢癌HO-8910、SKOV3和A2780細胞中進行體外實驗，100nMDex（人工合成的GC）處理細胞，用含10％去激素血清的培養(yǎng)基以去除血清中的激素對細胞的影響。羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色肌動蛋白(actin)，共聚焦顯微鏡拍照。Transwell小室和細胞劃痕實驗分別檢測細胞的垂直和水平遷移能力。預(yù)包被M

9、atrigel膠的Transwell小室（侵襲小室）檢測細胞的侵襲能力。細胞粘附實驗檢測細胞與細胞外基質(zhì)的粘附能力。Rho-GTP pull down實驗檢測RhoB和RhoC的活性。Western Blot檢測蛋白的表達和蛋白的磷酸化水平。siRNA干擾實驗抑制目的基因的表達。流式細胞儀檢測細胞表面整合素的分布。ELISA方法檢測纖連蛋白(FN)的分泌。
　　體內(nèi)實驗我們采用BABL/c裸鼠腹腔注射卵巢癌細胞制備轉(zhuǎn)移瘤模型。飲水

10、中給予皮質(zhì)酮（小鼠體內(nèi)的GC）升高裸鼠血漿皮質(zhì)酮水平。放射免疫方法檢測裸鼠血漿皮質(zhì)酮水平。HE染色確定轉(zhuǎn)移灶的病理性質(zhì)。嘌呤霉素篩選法篩選穩(wěn)定干擾RhoB的卵巢癌細胞。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬〨C在體外和體內(nèi)均能促進卵巢癌細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　1、人工合成的GC-地塞米松(Dex)在體外能促進卵巢癌細胞形態(tài)發(fā)生纖維樣改變，誘導(dǎo)細胞骨架重組（應(yīng)力纖維增多），增強細胞與細胞外基質(zhì)的粘附能力，促進細胞遷移和侵襲。

11、>　　2、在BABL/c裸鼠腹腔注射卵巢癌細胞制備的轉(zhuǎn)移瘤模型中，給予皮質(zhì)酮（小鼠體內(nèi)的GC）飲水(50mg/L)能明顯升高裸鼠血漿皮質(zhì)酮水平，并在體內(nèi)促進卵巢癌細胞腹腔和肝臟轉(zhuǎn)移。
　?。ǘ〨C能影響多種轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路分子的表達和/或活性，促進卵巢癌細胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　1、糖皮質(zhì)激素受體(GR)拮抗劑RU486能完全阻斷Dex對卵巢癌細胞的遷移促進作用，表明Dex對卵巢癌細胞的促遷移作用通過GR介導(dǎo)。

12、　　2、Dex能促進卵巢癌細胞表達和分泌重要的細胞外基質(zhì)成分-纖連蛋白(FN)，并能增加細胞粘附分子整合素β1和α5（FN的受體）在卵巢癌細胞表面的分布，用FN siRNA干擾FN的表達能明顯抑制Dex對卵巢癌細胞的粘附、遷移和侵襲的促進作用。
　　3、Dex能激活PI3K/AKT信號通路，其激活最早的時間點在12小時，表明激活PI3K/AKT信號通路不是Dex的直接作用，F(xiàn)N siRNA干擾FN的表達能明顯抑制PI3K/AKT信

13、號通路的激活，提示整合素α5β1和FN結(jié)合導(dǎo)致的細胞粘附增強可能與PI3K/AKT信號通路的激活有關(guān)。用PI3K/AKT通路的抑制劑wortmanin能完全阻斷Dex誘導(dǎo)卵巢癌細胞骨架重組和Dex對卵巢癌細胞的遷移和侵襲的促進作用，表明PI3K/AKT通路的激活在Dex促進卵巢癌細胞遷移和侵襲的作用中十分重要。
　　4、小G蛋白Rho亞家族（RhoA，RhoB和RhoC）是重要的細胞遷移和運動的調(diào)控蛋白，與GTP結(jié)合是它們的活性形

14、式。我們發(fā)現(xiàn)Dex能激活RhoB和RhoC，Dex還能增加Rho下游的ROCK2蛋白的磷酸化水平，激活ROCK2。ROCK2的特異抑制劑Fasudil抑制ROCK2的活性后能明顯抑制Dex對卵巢癌細胞的遷移和侵襲的促進作用。
　　5、鑒于RhoA和RhoC促進細胞遷移的作用已經(jīng)十分明確，而RhoB在細胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用還不清楚，因此我們重點研究了Dex激活RhoB在其促進卵巢癌細胞黏附、遷移、侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移中可能的作用。體外

15、實驗發(fā)現(xiàn)用RhoB siRNA干擾RhoB表達能抑制Dex促進FN分泌以及激活PI3K/AKT信號通路的作用。更為重要的是，干擾RhoB的表達在體外能顯著抑制Dex對卵巢癌細胞的粘附、遷移和侵襲的促進作用，在體內(nèi)也能明顯抑制皮質(zhì)酮促進卵巢癌細胞肝轉(zhuǎn)移的作用。
　　6、Dex還能上調(diào)卵巢癌細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP3和MMP7的表達。用BB-94抑制MMPs的活性能明顯阻斷Dex對卵巢癌細胞的侵襲促進作用。
　　結(jié)論:

16、　　GC在體外和體內(nèi)均能促進卵巢癌細胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，該作用通過GR介導(dǎo)。GC能通過促進FN/integrin介導(dǎo)的粘附激活PI3K/AKT信號通路，并能激活RhoC/ROCK2信號通路，在GC促進卵巢癌細胞的遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用。GC還能通過上調(diào)和激活小G蛋白RhoB促進卵巢癌細胞的遷移、侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移，該作用與其促進FN分泌，增加細胞黏附進而激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)。此外GC上調(diào)的MMP3和MMP7表達也與GC促進卵