低氧和糖皮質(zhì)激素對(duì)GILZ表達(dá)的調(diào)節(jié)及其可能的機(jī)制.pdf

1、低氧導(dǎo)致的組織損傷與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。已證實(shí)機(jī)體對(duì)缺氧損傷的習(xí)服與適應(yīng)受糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)的影響。在低氧條件下分泌增多的GC能通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor,GR)的介導(dǎo),調(diào)節(jié)基因表達(dá),但是至今對(duì)于參與了低氧適應(yīng)的糖皮質(zhì)激素/受體(GC/GR)的靶基因還知之不多。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白(Glucocorticoid induced leucine zipper,G

2、ILZ)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的GC/GR靶蛋白,因其具有與GC類似的免疫抑制、抗炎、抑制細(xì)胞增殖等功能,被認(rèn)為是GC作用的重要介導(dǎo)子,因此我們推測(cè)GILZ有可能參與了GC對(duì)低氧的保護(hù)作用。迄今低氧對(duì)GILZ的表達(dá)是否影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題采用Real-time PCR及Western blot方法研究了低氧以及低氧和GC聯(lián)合處理對(duì)大鼠脾臟和體外培養(yǎng)細(xì)胞中GILZ表達(dá)的影響,并初步探討了其機(jī)制,以進(jìn)一步闡明GC對(duì)低氧適應(yīng)的機(jī)制。 一、在體

3、低氧和GC協(xié)同上調(diào)GILZ的表達(dá) 首先在體觀察了低氧能否導(dǎo)致GILZ表達(dá)的改變。將250～300g的健康雄性SD大鼠放入低氧艙(8％O2、92％N2)內(nèi)暴露不同時(shí)間,采用Real-time PCR及Western blot方法檢測(cè)大鼠脾和肺組織中GILZ的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),大鼠低氧暴露8h,12h,24h,脾組織中GILZ mRNA和蛋白的表達(dá)與對(duì)照相比均明顯增加,其中低氧8 h大鼠GILZ mRNA表達(dá)水平最高,約為對(duì)照大鼠

4、的2.2倍(p<0.05)。低氧12h組肺組織中GILZ mRNA表達(dá)約為對(duì)照的1.5倍(p<0.05)。 為了觀察在體低氧上調(diào)GILZ是否受GC的影響,我們將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、去腺(雙側(cè)腎上腺切除)常氧組、去腺地塞米松(dexamethasone,Dex)組(肌注5mg/kg)、去腺低氧組、去腺Dex(5mg/kg)和低氧聯(lián)合處理組,不同處理12h后檢測(cè)脾組織GILZ的表達(dá)。結(jié)果顯示,單純?nèi)ハ俳MGILZ mRNA降低至假手

5、術(shù)組的44％(p<0.01),給去腺大鼠肌注Dex處理后,其脾臟GILZ的mRNA水平明顯增高,約為去腺大鼠的13倍(p<0.01);去腺低氧組與單純?nèi)ハ俳M相比GILz的mRNA變化不明顯,但去腺后Dex聯(lián)合低氧處理組大鼠脾組織中GILZ的mRNA表達(dá)顯著高于去腺低氧組,約為去腺低氧組大鼠的10倍(p<0.01),也明顯高于去腺Dex組,約為去腺Dex大鼠的1.4倍(p<0.05)。蛋白水平的實(shí)驗(yàn)得到相似的結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)表明在體低氧上調(diào)G

6、ILZ的表達(dá)需要GC存在,而且低氧和GC能協(xié)同上調(diào)GILZ的表達(dá)。 二、GC能進(jìn)一步提高低氧時(shí)大鼠脾臟HIF-1α蛋白的水平參與低氧反應(yīng) 最重要的轉(zhuǎn)錄因子是低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)。低氧可以明顯提高HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性,從而使其在細(xì)胞內(nèi)的濃度升高。我們采用Western blot的方法觀察了大鼠在不同處理情況下HIF-1α蛋白水平的變化。 結(jié)果表明去

7、腺大鼠低氧暴露后,其脾臟HIF-1α的蛋白水平明顯增高。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明我們給予的低氧條件的確可以使大鼠處于低氧狀態(tài)。而去腺低氧聯(lián)合Dex組大鼠脾臟的HIF-1α蛋白進(jìn)一步增多,表明糖皮質(zhì)激素能進(jìn)一步增強(qiáng)HIF-1α蛋白在低氧時(shí)的穩(wěn)定性,從而可能增強(qiáng)機(jī)體的組織細(xì)胞對(duì)低氧的適應(yīng)性。 三、低氧和GC單獨(dú)或者協(xié)同上調(diào)RAW264.7細(xì)胞GILZ的表達(dá) 為了排除在體低氧導(dǎo)致的神經(jīng)內(nèi)分泌變化的影響,了解低氧是否可以直接影響GILZ的表達(dá)

8、,我們采用了體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞,將細(xì)胞放入低氧培養(yǎng)箱(1％O2)內(nèi)不同時(shí)間,檢測(cè)GILZ的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與對(duì)照相比,低氧組GILZ mRNA水平在4h時(shí)先輕度降低,之后逐漸增高,12h達(dá)到最高,約為對(duì)照的2.7倍(p<0.01),24h回落但仍高于對(duì)照水平。Western blot結(jié)果表明GILZ蛋白表達(dá)在低氧處理8h時(shí)上調(diào)明顯,12h仍維持上調(diào)水平,表明低氧能夠直接上調(diào)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞

9、中GILZ的表達(dá)。 在證實(shí)Dex能夠以時(shí)間依賴性的方式上調(diào)GILZ mRNA的表達(dá)的基礎(chǔ)上,進(jìn)-步觀察了細(xì)胞分別給予低氧、Dex(100 nM)單獨(dú)或者聯(lián)合處理12小時(shí),GILZ的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,低氧和Dex可以單獨(dú)上調(diào)GILZ mRNA的表達(dá),而GC和低氧聯(lián)合處理組GILZ mRNA表達(dá)比低氧和Dex單獨(dú)處理組都要明顯的高,蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果顯示了類似的變化趨勢(shì),表明GC和低氧在上調(diào)GILZ表達(dá)時(shí)二者有協(xié)同作用。

10、四、低氧上調(diào)GR的表達(dá) 上述實(shí)驗(yàn)證明低氧不僅單獨(dú)可以上調(diào)GILZ的表達(dá),而且可與Dex聯(lián)合作用協(xié)同上調(diào)GILZ的表達(dá)。為探討其機(jī)制,我們觀察了低氧單獨(dú)或者聯(lián)合Dex對(duì)GR表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,低氧可上調(diào)RAW264.7細(xì)胞GR mRNA和蛋白的表達(dá)。對(duì)去腺大鼠的研究表明,去腺后低氧聯(lián)合Dex處理組脾組織中GRmRNA蛋白質(zhì)的表達(dá)都比假手術(shù)組和去腺低氧組明顯增高。表明低氧可以通過(guò)上調(diào)GR從而增強(qiáng)GC誘導(dǎo)GILZ表達(dá)的作用。當(dāng)然由于

11、GILZ啟動(dòng)子上還存在有其他的轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)元件,因此不排除在低氧條件下其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活的轉(zhuǎn)錄因子也參與了對(duì)GILZ表達(dá)的調(diào)節(jié)。 五、低氧對(duì)炎癥因子IL-1β表達(dá)的影響 有研究證實(shí)GILZ可以通過(guò)抑制NF-kB的轉(zhuǎn)錄活性從而發(fā)揮抑炎的作用,而促炎細(xì)胞因子IL-1β是NF-kB的靶基因。因此我們進(jìn)一步觀察了低氧對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)的影響,以探討低氧上調(diào)GILZ與促炎細(xì)胞因子生成的關(guān)系。結(jié)果顯示,

12、RAW264.7細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)低氧4h增加至對(duì)照的1.7倍(p<0.05),之后下降,12h約降至對(duì)照的40％(p<0.05)。IL-1mRNA表達(dá)變化的趨勢(shì)與低氧對(duì)GILZmRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)趨勢(shì)正好相反,而大鼠低氧處理12h后脾組織IL-1βmRNA表達(dá)變化也與GILZ相反,提示低氧上調(diào)GILZ表達(dá)可能是低氧適應(yīng)的機(jī)制之一,并與GC抑制低氧導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。當(dāng)然其確切的關(guān)系還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。 綜上所述

13、,對(duì)大鼠和體外培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)：低氧和GC單獨(dú)都可以上調(diào)GILZ mRNA和蛋白的表達(dá),二者共同作用時(shí)具有協(xié)同效應(yīng),該作用與低氧能上調(diào)GR的表達(dá)有關(guān),Dex還能進(jìn)一步提高低氧時(shí)大鼠脾臟HIF-1α蛋白的水平,從而增強(qiáng)組織細(xì)胞對(duì)低氧的適應(yīng)性。初步實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)大鼠低氧暴露后GILZ的表達(dá)水平與IL-1β mRNA的表達(dá)程度呈負(fù)相關(guān),推測(cè)低氧上調(diào)GILZ的表達(dá)是低氧適應(yīng)的機(jī)制之一,并與GC抑制低氧導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)有關(guān)。以上結(jié)果