低氧和糖皮質(zhì)激素上調(diào)stomatin的機(jī)制及其生物學(xué)意義.pdf

1、缺氧是最重要的應(yīng)激反應(yīng)之一，是也臨床最常見的病理生理過程，與心血管疾病和高原性肺水腫等的發(fā)生密切相關(guān)。糖皮質(zhì)激素作為體內(nèi)最重要的應(yīng)激激素，在機(jī)體對低氧適應(yīng)中發(fā)揮重要作用。人工合成的糖皮質(zhì)激素-地塞米松（Dex）在臨床上被廣泛用于治療肺水腫和肺損傷，它的這種作用是通過降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性、加速肺泡腔中液體的清除以及增強(qiáng)肺上皮屏障功能來實現(xiàn)的。Stomatin是一個重要的脂筏標(biāo)志蛋白，它廣泛表達(dá)在人和小鼠的各組織細(xì)胞中，參與脂筏結(jié)構(gòu)的裝

2、配，囊泡運(yùn)輸、物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、以及對離子通道和細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)等生理過程。但是迄今對stomatin的功能了解的有限，對其在生理和病理條件下的調(diào)節(jié)研究的更少。我們前期研究了低氧和地塞米松（Dex）單獨(dú)及聯(lián)合作用對大鼠肺臟和人肺腺癌A549細(xì)胞stomatin表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧和Dex在體內(nèi)和體外均可以上調(diào)stomatin的表達(dá)。本課題將從細(xì)胞和整體水平進(jìn)一步確定糖皮質(zhì)激素和低氧單獨(dú)或共同作用對stomatin基因表達(dá)的影響，在此基礎(chǔ)

3、上，重點(diǎn)研究低氧和地塞米松上調(diào)stomatin表達(dá)的機(jī)制，并初步探討stomatin表達(dá)上調(diào)的生物學(xué)意義。采用ReAltime-PCR和Western Blot的方法，我們首先在大鼠肺臟和原代培養(yǎng)的肺泡上皮細(xì)胞水平進(jìn)一步證實了地塞米松和低氧不僅單獨(dú)可誘導(dǎo)stomatin的表達(dá)，二者還能聯(lián)合上調(diào)stomatin表達(dá)。接下來我們研究了低氧和地塞米松上調(diào)stomatin的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，stomatin mRNA 有一個相當(dāng)長的半衰期，約為3

4、2小時，低氧和地塞米松處理都能夠增強(qiáng)stomatin mRNA的穩(wěn)定性, 使它的半衰期分別延長至原來的1.22倍和1.5倍。我們用熒光素酶報告基因?qū)嶒炑芯堪l(fā)現(xiàn)，低氧不能誘導(dǎo)stomatin 啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，與低氧不同的是，地塞米松能夠以時間和濃度依賴性的方式誘導(dǎo)stomatin啟動子的活性，這個結(jié)果表明地塞米松也能夠直接在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)stomatin mRNA的表達(dá)。為了進(jìn)一步定位stomatin 啟動子對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)反應(yīng)的位點(diǎn)，

5、我們構(gòu)建了一系列含stomatin 啟動子5’端不同截短形式的報告基因載體，熒光素酶活性分析試驗表明，啟動子的-162 至+244 區(qū)域是對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)反應(yīng)所不可缺少的，而且這一區(qū)域在多種細(xì)胞類型中均貢獻(xiàn)了stomatin基因的絕大部分基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性，因此我們推測這一區(qū)域是它的核心啟動子區(qū)。隨后，我們用軟件預(yù)測了這一區(qū)域所包含的可能介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并且構(gòu)建了這些位點(diǎn)的相應(yīng)突變型報告基因載體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中一個位

6、點(diǎn)GRE3，突變之后能夠使stomatin 啟動子失去對地塞米松的誘導(dǎo)反應(yīng)，這說明GRE3 介導(dǎo)了地塞米松對stomatin的誘導(dǎo)反應(yīng)。因此我們認(rèn)為，地塞米松在轉(zhuǎn)錄水平上對stomatin的誘導(dǎo)是通過激活的糖皮質(zhì)激素受體與這個GRE3 位點(diǎn)結(jié)合來實現(xiàn)的。最后，我們用激光共聚焦顯微鏡的方法觀察了A549細(xì)胞中stomatin的表達(dá)與actin細(xì)胞骨架的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，stomatin在膜周與actin細(xì)胞骨架存在共定位。低氧暴露或Dex