糖皮質(zhì)激素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)是由腎上腺皮質(zhì)合成和分泌的應(yīng)激激素，其濃度受下丘腦-垂體-腎上腺(Hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis，HPA軸)軸的調(diào)控。正常生理狀態(tài)下，糖皮質(zhì)激素對(duì)維持機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)的正常生長(zhǎng)發(fā)育以及生理和應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定都極為重要。糖皮質(zhì)激素作為很強(qiáng)的免疫抑制劑參與體內(nèi)多種代謝過程，調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能。研究證實(shí)，應(yīng)激反應(yīng)時(shí)腎上腺糖皮質(zhì)激素過度分

2、泌與生殖內(nèi)分泌疾病密切相關(guān)，糖皮質(zhì)激素能在下丘腦水平擾亂GnRH神經(jīng)元的正常生理活動(dòng)，從而抑制其生殖內(nèi)分泌功能。GC能夠通過糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor, GR)介導(dǎo)直接作用于促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)神經(jīng)元，從而影響GnRH神經(jīng)元的正常生理活動(dòng)。下丘腦GnRH神經(jīng)元上存在GR，同時(shí)，應(yīng)激狀態(tài)下的糖皮質(zhì)激素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一定影響。星

3、形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞的主要組成部分，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞除了參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和神經(jīng)退行性疾病以及具有巨噬細(xì)胞的功能以外，在調(diào)控生殖方面也具有重要作用。研究表明，下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming growth factor-alpha，TGFβ）等活性因子，與GnRH神經(jīng)元上相應(yīng)的受體結(jié)合，促進(jìn)GnRH的合成和分泌，控制生

4、殖活動(dòng)。另外，下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞還能通過黏合分子和GnRH神經(jīng)元結(jié)合，完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促使GnRH神經(jīng)元分泌GnRH，從而調(diào)控生殖活動(dòng)。但是星形膠質(zhì)細(xì)胞能否直接分泌GnRH來控制生殖活動(dòng)，還未見報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的大鼠下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞，探究糖皮質(zhì)激素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH的調(diào)控機(jī)制。因此，需要獲得較純的下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)采用重慶市中藥研究所提供的1～—3日齡的SD新生大鼠，經(jīng)過原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)，在經(jīng)過多次純

5、化和傳代培養(yǎng)獲得純化率達(dá)99％以上的星形膠質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)過以上方法所得的星形膠質(zhì)細(xì)胞可為體外研究提供符合要求的細(xì)胞。
　　本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的符合要求的星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過免疫熒光，熒光定量PCR，GnRH ELISA試劑盒檢驗(yàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞是否分泌GnRH，結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌GnRH。
　　為了檢驗(yàn)GC對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte，AST)表達(dá)GnRH的影響，本實(shí)驗(yàn)通過采用10-6mol/L，10-7mol/L，1

6、0-8mol/L的GC刺激培養(yǎng)的AST，分別檢測(cè)10min、20min、30min、40min時(shí)AST GnRH水平，選出最佳時(shí)間和濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用10-8mol/L的GC刺激培養(yǎng)的AST，在30min時(shí)GnRH的表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著升高(P＜0.05)，該實(shí)驗(yàn)濃度和時(shí)間為最佳實(shí)驗(yàn)濃度和時(shí)間。
　　為了檢驗(yàn)GC對(duì)AST GR的影響，本實(shí)驗(yàn)通過采用10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L的GC刺激培養(yǎng)的AST，分

7、別檢測(cè)10min、20min、30min、40min時(shí)AST糖皮質(zhì)激素受體(GR)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10-8mol/L的GC刺激培養(yǎng)的AST，在40min時(shí)AST GR表達(dá)量較其他實(shí)驗(yàn)組顯著升高(P＜0.05)。
　　為了研究GC對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH的調(diào)節(jié)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用10-8mol/L的牛血清白蛋白偶聯(lián)的糖皮質(zhì)激素(BSA-GC)，10-6mol/L的糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486，10-8mol/L GC刺激AST，在30

8、min時(shí)檢測(cè)GnRH的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RU486+GC組、GC組和GC+BSA-GC組AST GnRH較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），證明短時(shí)間內(nèi)GC刺激AST分泌GnRH是通過非基因組效應(yīng)作用。
　　為了了解GC作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)的AST，分別加10μM p38抑制劑SB203580、10μM ERK-1/-2抑制劑U0126、10μM JNK抑制劑SP600125。GC組加0μM SB203580、U0126和SP

9、600125，繼續(xù)培養(yǎng)30min后，分別加入10-8mol/L的GC，在10min、20min、30min、40min時(shí)測(cè)定AST GnRH水平。對(duì)照組加入等體積的無水乙醇，在10min、20min、30min、40min時(shí)測(cè)定AST GnRH水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SB203580+GC組和U0126+GC組AST GnRH表達(dá)水平較對(duì)照組顯著下降(P＜0.05)，SP600125+GC組AST GnRH表達(dá)水平變化不明顯(P＞0.05)。證明

10、GC可以通過p38MAPK、ERK-1/-2MAPK轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑促進(jìn)AST GnRH的表達(dá)。
　　為了進(jìn)一步探索GC作用的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否是PKC-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)的AST，加入1μM pkc抑制物星形孢菌素，繼續(xù)培養(yǎng)30min后，分別加入10-8mol/L的GC，在10min、20min、30min、40min時(shí)p38、ERK-1/-2、的磷酸化情況;在10min、20min、30min、40min時(shí)測(cè)定AS

11、T GnRH水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入PKC抑制劑+GC組AST GnRH的分泌較對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)，證明GC作用的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游信號(hào)途徑和PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。
　　綜上所述，該實(shí)驗(yàn)可以得到以下結(jié)論:
　　1、體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)糖皮質(zhì)激素受體，為研究糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能奠定了形態(tài)學(xué)依據(jù)。
　　2、首次發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌GnRH，這為星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控生殖提供了重要的生理學(xué)依據(jù)。