P38 MAPK和GCR在糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞GnRH表達(dá)中的作用.pdf

1、糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoid,GC）是一種類固醇激素，其濃度受到下丘腦-垂體-腎上腺（Hypothalamic-pituitary-adrenocoyical axis,HPA）軸的調(diào)控，在維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)生殖及免疫等功能中發(fā)揮了重要作用。促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-relesaing horme,GnRH）是一種10肽激素，是繁殖活動(dòng)最重要的調(diào)節(jié)激素，主要通過(guò)下丘腦-垂體-性腺（Hypothalami

2、c-pituitary-gonadal,HPG）軸來(lái)對(duì)生殖活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控。在應(yīng)激情況下，HPA軸主要通過(guò)分泌GC影響HPG軸，從而影響生殖，母畜的生殖能力會(huì)通過(guò)此種方式而下降。星形膠質(zhì)細(xì)胞在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中占據(jù)重要地位，尤其在生殖、免疫、應(yīng)激等方面。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已完成的工作中，已經(jīng)在體外證明了星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌GnRH，然而其受到哪種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)仍然未知。GC-GCR是糖皮質(zhì)激素發(fā)揮經(jīng)典基因組效應(yīng)的系統(tǒng)，P38 MAPK是與免疫相關(guān)

3、的最重要信號(hào)通路。但其兩者在星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH中發(fā)揮怎樣的作用，未有相關(guān)資料報(bào)道。因此，在應(yīng)激情況下星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH會(huì)發(fā)生怎樣的變化，星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH會(huì)受到怎樣的調(diào)節(jié)成為了本實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)利用體外培養(yǎng)的大鼠下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞，探究P38 MAPK和GCR在糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的GnRH表達(dá)中的作用，其中主要研究?jī)?nèi)容如下：
　?。?）不同濃度GC對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH的影響；

4、>　?。?）GCR在GC刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH中的作用；
　?。?）P38 MAPK信號(hào)通路對(duì)GC刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH的影響；
　?。?）P38 MAPK下游核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB對(duì)GC刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH的影響。
　　（1）為了有效的探究P38 MAPK和GCR在糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的GnRH表達(dá)中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用1～3日齡的雌性SD新生大鼠，培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)原代培養(yǎng)、純化和傳代

5、培養(yǎng)，獲得所需細(xì)胞，經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白-膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）免疫熒光染色檢驗(yàn)細(xì)胞，所得細(xì)胞的純化率達(dá)99％以上，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　?。?）為了研究不同濃度GC對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH的影響，以糖皮質(zhì)激素類似物地塞米松（DEX）刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞，用10-4 mol/L、10-5 mol/L、10-6 mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L的DEX分別處理1 h、12 h、24 h、48 h后，利

6、用ELISA檢測(cè)不同濃度GC對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GnRH的分泌情況、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GnRH的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，并利用Western Blot檢測(cè)在各濃度GC處理下GCR的變化情況，結(jié)果顯示，1 h、12 h、24 h、48 h時(shí)10-4 mol/L、10-5 mol/L、10-6 mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L GC處理組的蛋白及mRNA轉(zhuǎn)錄水平均在不同階段顯著高于對(duì)照組（P<0.05），GCR在各時(shí)間段中

7、對(duì)10-8 mol/L濃度的GC最為敏感，綜合分析確定10-8 mol/L的GC為最佳的實(shí)驗(yàn)處理濃度。
　?。?）為了研究GCR在GC刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH中的作用，通過(guò)使用10-8 mol/L DEX-BSA與DEX分別刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞，分別設(shè)置GC-BSA組、GC組和對(duì)照組，用免疫熒光方法檢測(cè)GCR的激活情況，并利用ELISA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)各組GnRH分泌量和mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，GC組在

8、1 h、24 h轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），12 h、24 h的蛋白水平顯著高于對(duì)照組證明（P<0.05），而GC-BSA組在各時(shí)間段與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，證明當(dāng)GCR激活后能夠促進(jìn)糖皮質(zhì)激素刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞GnRH的分泌。
　?。?）為了研究P38 MAPK信號(hào)通路是否對(duì)GC刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH具有調(diào)節(jié)作用，通過(guò)使用10μmol/L的P38阻斷劑SB203580及10-8 mol/L DEX處理，分別設(shè)置

9、P38阻斷劑組、P38阻斷劑+GC組、GC組與對(duì)照組，分別處理1 h、12 h、24 h、48 h后，檢測(cè)各組GnRH分泌量、mRNA水平的變化及GCR激活情況，結(jié)果顯示在12 h、24 h時(shí)P38阻斷劑+GC組與GC組的蛋白及轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），且P38阻斷劑+GC組在mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于GC組（P<0.05），而在48 h時(shí)P38阻斷劑+ GC組仍保持較高的分泌水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而P38阻

10、斷劑組的蛋白與轉(zhuǎn)錄水平在各時(shí)間段與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，綜上所述表明，在GCR激活后，阻斷P38 MAPK信號(hào)通路對(duì)GC刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH具有上調(diào)作用。
　?。?）為了研究P38 MAPK對(duì)激活下游核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的影響，通過(guò)使用10μmol/L的P38阻斷劑SB203580及10-8 mol/L DEX處理，分別設(shè)置P38阻斷劑組、P38阻斷劑+GC組、GC組與對(duì)照組，分別處理1 h、12 h、24 h、48 h后，

11、并通過(guò) WesternBlot檢測(cè)不同時(shí)間NF-κB（P65）磷酸化情況。結(jié)果顯示1 h、12 h時(shí)GC處理組的磷酸化P65表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組（P<0.01），24 h時(shí)顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；1 h、12 h時(shí)P38阻斷劑組、P38阻斷劑+GC組的磷酸化P65表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組（P<0.01），24 h時(shí)、P38阻斷劑+GC組顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；1 h、12 h時(shí)P38阻斷劑組與P38阻斷劑+GC組的磷酸化

12、P65表達(dá)量無(wú)顯著差異（P>0.05）。證明經(jīng)GC處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞的磷酸化P65表達(dá)量會(huì)增加，在加入P38阻斷劑后的星形膠質(zhì)細(xì)胞磷酸化P65表達(dá)量會(huì)降低，并且該過(guò)程不會(huì)受到GC的刺激而增加。綜上可知，P38 MAPK是引起核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB磷酸化的關(guān)鍵激酶。
　?。?）為了研究P38 MAPK信號(hào)通路下游的NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子是否對(duì)GC刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH具有調(diào)節(jié)作用，通過(guò)使用10μmol/L NF-κB阻斷劑BAY

13、11-7082及10-8 mol/L DEX處理，分別設(shè)置NF-κB阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+GC組、GC組與對(duì)照組，分別處理1 h、12 h、24 h、48 h后，檢測(cè)各組GnRH分泌量、mRNA水平的變化及GCR信號(hào)通路激活情況，結(jié)果顯示在12 h、24 h時(shí)NF-κB阻斷劑+GC組、GC組的蛋白水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而NF-κB阻斷劑+GC組在1 h、12 h、24 h、48 h極顯著高于對(duì)照組與GC組（P<0.0

14、1）結(jié)果證明，在GCR激活后阻斷P38 MAPK信號(hào)通路下游的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB對(duì)GC刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH具有上調(diào)作用。
　　綜上所述，該試驗(yàn)可以得到以下結(jié)果：
　　1、糖皮質(zhì)激素在10-8 mol/L至10-4 mol/L濃度范圍內(nèi)，均能促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中分泌GnRH，且糖皮質(zhì)激素濃度越高這種促進(jìn)分泌作用時(shí)間越長(zhǎng)。
　　2、糖皮質(zhì)激素能夠通過(guò)激活GCR促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH。
　　3、當(dāng)GCR激