α7煙堿受體在糖皮質激素調節(jié)小膠質細胞炎癥反應中的作用.pdf

1、研究背景:
　　小膠質細胞是存在于中樞神經系統內的免疫細胞,其持續(xù)激活可引起腦內的慢性神經炎癥反應,并導致神經元損傷。內源性糖皮質激素(Glucocoticoids,GCs)介導的體液抗炎通路在腦內炎癥反應調節(jié)中發(fā)揮重要作用,小膠質細胞上可高表達糖皮質激素受體(Glucocoticoid receptor,GR),是GCs的直接抗炎靶標。α7煙堿型乙酰膽堿受體(alpha7 nicotinic acetylcholine rece

2、ptor,α7nAChR)作為一種新的炎癥調節(jié)機制—膽堿能神經抗炎通路(Cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP)的關鍵分子,亦大量表達于小膠質細胞。研究顯示小膠質細胞α7nAChR與神經炎癥反應密切相關,激動α7nAChR可以抑制神經炎癥反應,表明小膠質細胞α7nAChR介導的抗炎作用是機體調節(jié)神經炎癥反應的另一重要機制。作為機體內兩條重要的內源性抗炎通路,生理濃度GCs與CAP通路在腦內炎癥

3、調節(jié)中的關系如何,兩者之間是否存在關聯,對該類問題的研究尚未有報道。小膠質細胞上同時表達GR和α7nAChR,可作為體液和CAP通路的共同抗炎靶標,且對神經元的研究表明,GCs可以調節(jié)α7nAChR表達。這些證據均提示GCs可能通過CAP通路調節(jié)小膠質細胞引起的炎癥反應。因此,本研究擬利用小膠質細胞探討 GCs介導的體液抗炎通路與α7nAChR介導的CAP通路之間的關系,進一步揭示腦內炎癥反應的調節(jié)機制。
　　目的:
　　探

4、討小膠質細胞α7nAChR在生理濃度糖皮質激素調節(jié)炎癥反應中的作用,揭示體液與膽堿能抗炎通路之間的關系,并初步闡明其調節(jié)機制。
　　方法:
　　本實驗藥物選用糖皮質激素類中的氫化可的松(Hydrocortisone,Hydr),其生理濃度范圍為110-520nM。MTT法檢測不同濃度Hydr對bv-2小膠質細胞活性的影響,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激bv-2小膠質細胞造成炎癥模型。在建立炎癥模型

5、的基礎上,分為空白對照組、LPS組、Hydr+LPS組,ELISA方法檢測炎癥介質TNF-α、IL-1β釋放水平,觀察高濃度和生理濃度Hydr對其的影響;其次,加入α7nAChR拮抗劑甲基牛扁亭堿(Methyllycaconitine,MLA),分為空白對照組、LPS組、Hydr(300nM)+LPS組、MLA(10nM)+Hydr(300nM)+LPS組,使用ELISA方法檢測炎癥介質TNF-α、IL-1β釋放水平,并觀察小膠質細胞形

6、態(tài)學的變化情況,以探索生理濃度 Hydr是否通過α7nAChR在抗炎中起作用;最后,分為空白對照組、Hydr組、MLA+Hydr組,采用RT-PCR檢測Hydr對α7nAChR、GR mRNA表達的影響,Western blot檢測Hydr對α7nAChR蛋白質水平的影響,探討體液抗炎與膽堿能抗炎之間的聯系。
　　結果:
　　1.生理濃度的糖皮質激素對LPS誘致炎癥反應的抑制作用:
　　(1) MTT結果顯示,與空白組

7、相比,2000nM Hydr可使細胞活性顯著降低(P<0.01),1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM的Hydr對細胞活性無明顯影響。
　　(2)經LPS刺激,bv-2細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β的含量隨著刺激濃度的增加和刺激時間的延長逐漸遞增,呈現時間和劑量依賴性的關系;經不同濃度的Hydr給藥預作用后,生理濃度范圍(110-520nM)內Hydr(500,250nM)可顯著降

8、低TNF-α、IL-1β的生成量(P<0.01,P<0.05)。
　　2.α7nAChR在介導生理濃度的糖皮質激素抑制炎癥反應中的作用:
　　(1) Hydr(300nM)可顯著降低TNF-α、IL-1β的生成量(P<0.01),這一作用可被α7nAChR特異性拮抗劑MLA(10nM)拮抗(P<0.01,P<0.05)。
　　(2) Hydr(300nM)可顯著抑制小膠質細胞bv-2的激活,減少細胞分枝和偽足的生成,而

9、這一作用同樣可被α7nAChR特異性拮抗劑MLA(10nM)拮抗。
　　3.生理濃度的糖皮質激素對α7nAChR和GR受體的調控情況:
　　(1) Hydr(300nM)可增加bv-2細胞α7nAChR mRNA表達,這一作用同樣可被MLA(10nM)拮抗。
　　(2) Hydr(300nM)可增加bv-2細胞GR mRNA表達。MLA(10nM)對這一作用無拮抗。
　　(3) Hydr(300nM)可增加bv-