巨噬細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)在小鼠皮膚傷口修復(fù)中的調(diào)控作用.pdf

1、研究背景：
　　創(chuàng)傷修復(fù)（wound healing）是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中一個(gè)非常熱點(diǎn)的問(wèn)題。人們?cè)谘装Y細(xì)胞、組織細(xì)胞、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子以及細(xì)胞外基質(zhì)等方面都對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)做了大量的研究，使我們對(duì)機(jī)體的這種復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。
　　巨噬細(xì)胞（macrophage）在創(chuàng)傷修復(fù)中的作用，尤其得到大家的關(guān)注，并對(duì)其做了深入的研究,認(rèn)為巨噬細(xì)胞在創(chuàng)傷修復(fù)的各個(gè)階段（炎癥反應(yīng)期、細(xì)胞增殖與肉芽形成期和組織重塑期）都發(fā)揮著

2、十分重要的作用。沒(méi)有巨噬細(xì)胞就不能完成創(chuàng)傷修復(fù),或者巨噬細(xì)胞的功能發(fā)生障礙也會(huì)明顯影響整個(gè)創(chuàng)傷修復(fù)的進(jìn)程。
　　糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)作為一種抗炎和免疫抑制藥物在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，然而長(zhǎng)時(shí)間、大劑量或者不規(guī)范的使用也會(huì)帶來(lái)一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)和并發(fā)癥，有時(shí)甚至影響生命。延遲創(chuàng)傷修復(fù)作為GC的一個(gè)不良反應(yīng)在臨床上和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中早已被大家觀察和認(rèn)識(shí)到，雖然人們也做了初步的探索，但是到目前為止對(duì)其中的機(jī)制仍沒(méi)

3、有得到全面和詳細(xì)的闡明。
　　基于上述研究背景，本文以小鼠皮膚傷口修復(fù)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以地塞米松（dexamethasone，Dex）作為GC的經(jīng)典代表，從巨噬細(xì)胞的角度探討GC延遲傷口修復(fù)的作用及其機(jī)制。
　　第一部分糖皮質(zhì)激素延遲小鼠皮膚傷口愈合與傷口局部巨噬細(xì)胞數(shù)目減少有關(guān)
　　目的：1.證實(shí)GC延遲小鼠皮膚傷口愈合；
　　2.證實(shí)GC減少小鼠皮膚傷口局部巨噬細(xì)胞數(shù)目；
　　3.研究GC對(duì)小鼠皮膚傷口局部

4、組織及巨噬細(xì)胞的糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）水平的影響。
　　方法：小鼠皮膚傷口修復(fù)模型制作完成后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別用Dex和PBS處理，在大體水平每天測(cè)量傷口直徑、隔天拍照傷口愈合情況；傷后第7天取兩組小鼠皮膚傷口局部組織進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色,在顯微鏡下觀察測(cè)量傷口直徑并拍照；傷后第7天分別用免疫組織化學(xué)法和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)兩組小鼠皮膚傷口局部

5、組織巨噬細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行檢測(cè)；傷后第7天用Real-time PCR對(duì)兩組小鼠皮膚傷口局部組織以及局部巨噬細(xì)胞的GR的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：1.創(chuàng)傷后第6天和第9天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組傷口直徑分別為3.2±0.2mm,1.9±0.1mm（***，p＜0.001）和2.5±0.1mm,1.0±0.2mm（***，p＜0.001）；傷后第7天在組織學(xué)水平測(cè)量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組傷口直徑分別為3.2±0.2mm,1.2±0.4mm（**，

6、p＜0.01）；可以看出實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚傷口愈合明顯延遲。
　　2.用免疫組織化學(xué)法對(duì)傷后第7天傷口局部巨噬細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示每個(gè)高倍鏡視野下F4/80+(巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志物)細(xì)胞數(shù)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別為18.0±1.7,37.3±3.5（**，p＜0.01）；用流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)，得到一致的結(jié)果，即Dex可以明顯減少傷口局部巨噬細(xì)胞數(shù)目。
　　3.對(duì)傷后第7天傷口局部組織以及局部巨噬細(xì)胞GR的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)

7、果發(fā)現(xiàn)Dex可以顯著提高傷口局部組織和局部巨噬細(xì)胞GR的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)論：GC可以減少傷口局部巨噬細(xì)胞數(shù)目，從而延遲小鼠皮膚傷口愈合，并且可能是通過(guò)GR信號(hào)發(fā)揮作用的。
　　第二部分糖皮質(zhì)激素通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞遷移導(dǎo)致傷口局部巨噬細(xì)胞數(shù)目減少
　　目的：探討GC導(dǎo)致小鼠皮膚傷口局部巨噬細(xì)胞數(shù)目減少的初步機(jī)制。
　　方法：首先我們用 ELISA法檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠血清中趨化因子CXCL1,CXCL2的水平，

8、并用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)體外培養(yǎng)的兩組巨噬細(xì)胞表面的趨化因子受體CXCR2的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。然后我們分別用經(jīng)典的體內(nèi)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和體外Trans-well實(shí)驗(yàn)對(duì)Dex和PBS處理的巨噬細(xì)胞遷移能力進(jìn)行了評(píng)估，并對(duì)遷移后巨噬細(xì)胞CXCR2的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，最后從形態(tài)學(xué)上對(duì)體外培養(yǎng)的兩組巨噬細(xì)胞進(jìn)行了觀察。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中CXCL1,CXCL2的水平明顯降低；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞趨化因子受體 CXC

9、R2的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity,MFI)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組也明顯減弱；體內(nèi)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和體外Trans-well實(shí)驗(yàn)對(duì)巨噬細(xì)胞遷移能力進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dex可以明顯抑制巨噬細(xì)胞的遷移，另外對(duì)遷移后的巨噬細(xì)胞趨化因子受體CXCR2水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞CXCR2顯著降低。體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察表明Dex可以抑制巨噬細(xì)胞偽足的生長(zhǎng)。
　　結(jié)論：GC可能是通過(guò)下調(diào)CXCL1/

10、2-CXCR2來(lái)抑制巨噬細(xì)胞的遷移，從而導(dǎo)致小鼠皮膚傷口局部巨噬細(xì)胞數(shù)目減少。
　　第三部分糖皮質(zhì)激素通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)減少傷口局部巨噬細(xì)胞數(shù)目并延遲皮膚傷口愈合
　　目的：初步探討 GC使傷口局部巨噬細(xì)胞數(shù)目減少，導(dǎo)致小鼠皮膚傷口愈合延遲的信號(hào)通路。
　　方法：我們采用了GR的阻斷劑——米非司酮（mifepristone，RU486）阻斷GC-GR信號(hào)通路后，再次進(jìn)行了小鼠皮膚傷口修復(fù)實(shí)驗(yàn)。將小鼠分為三組:PBS

11、組，每天腹腔注射PBS； Dex組，每天腹腔注射Dex溶液（5mg/kg）； Dex+RU486組，每天注射Dex溶液(5mg/kg)和RU486溶液（2mg/kg）。然后同第一部分，我們分別從大體水平和組織學(xué)水平評(píng)估小鼠皮膚傷口愈合情況，并用免疫組織化學(xué)法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)傷口局部巨噬細(xì)胞的數(shù)目，同時(shí)檢測(cè)傷口局部巨噬細(xì)胞GR的水平。
　　結(jié)果：從大體水平和組織學(xué)水平得到的結(jié)果均發(fā)現(xiàn)：Dex+RU486組小鼠皮膚傷口愈合速度明顯較D

12、ex組加快，幾乎接近PBS組小鼠皮膚傷口愈合速度。免疫組織化學(xué)法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)傷口局部巨噬細(xì)胞數(shù)目,結(jié)果顯示：小鼠皮膚傷口局部巨噬細(xì)胞（F4/80+和CD11b+F4/80+細(xì)胞)數(shù)目Dex+RU486組和PBS組接近，都較Dex組顯著增加。此外流式細(xì)胞術(shù)對(duì)傷口局部巨噬細(xì)胞GR的水平檢測(cè)的結(jié)果顯示：Dex+RU486組小鼠傷口巨噬細(xì)胞GR的MFI較Dex組明顯減弱，而與PBS組無(wú)差異。
　　結(jié)論：GC確實(shí)是通過(guò)GC-GR信號(hào)抑制