預(yù)測mmu-miR-30a調(diào)控糖皮質(zhì)激素受體及二者在小鼠足細(xì)胞上的表達(dá).pdf

1、第一部分
　　 應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測GR mRNA是mmu-miR-30a的可能靶基因
　　 目的：預(yù)測miRNA靶基因是否為糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid Receptor，GR) mRNA。
　　 方法：使用miRBase(http://www.mirbase.org)獲得miR-30a基因序列；使用Pubmed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲得基因NR3C1序列；分別

2、使用miRanda、TargetScan、PicTar生物信息學(xué)軟件對mmu-miR-30a的靶基因進(jìn)行尋找與預(yù)測。
　　 結(jié)果：miRanda、TargetScan和PicTar均預(yù)測到mmu-mir-30a的靶基因為糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid Receptor，GR)mRNA。
　　 結(jié)論：GR mRNA是mmu-miR-30a的可能靶基因
　　
　　 第二部分
　　 小鼠

3、足細(xì)胞中GRα及mmu-miR-30a的表達(dá)變化
　　 目的：探討GRα與mmu-miR-30a在小鼠足細(xì)胞系MPC5(mouse podocyte clone5，MPC5)中的表達(dá)變化。
　　 方法：
　　 條件永生型小鼠足細(xì)胞系MPC5培養(yǎng)：將復(fù)蘇MPC5細(xì)胞于33℃中增殖培養(yǎng)，平均3～4天達(dá)90％以上融合傳代。換于37℃中培養(yǎng)，10～14天分化為成熟，此時為分化態(tài)MPC5;將以上兩種細(xì)胞分為兩組，通過反轉(zhuǎn)錄

4、酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、免疫蛋白印跡(Western-blot)、免疫熒光顯微鏡檢測Nephrin、Synaptopodin、GRα在未分化態(tài)與分化態(tài)MPC5中的表達(dá)，觀察變化：通過實時熒光定量PCR反應(yīng)(qRT-PCR)檢測mmu-miR-30a在未分化態(tài)與分化態(tài)MPC5中的表達(dá)，觀察變化；
　　 結(jié)果：
　　 MPC5細(xì)胞在33℃有γ-INF的1640培養(yǎng)液中生長，細(xì)胞體小而突起，細(xì)胞間排列緊密，呈鵝卵石樣

5、，部分區(qū)域有管腔樣結(jié)構(gòu)，足突樣結(jié)構(gòu)少見，平均3～4天即達(dá)到90%融合，在37℃無γ-INF條件培養(yǎng)下的足細(xì)胞較33℃的胞體透明，呈多角形，細(xì)胞間相對疏松，管腔樣結(jié)構(gòu)增多，生長速度明顯減緩，3～4天后細(xì)胞即停止增殖，1周后星型細(xì)胞樣細(xì)胞形成，樹枝狀的足突結(jié)構(gòu)明顯，可見細(xì)胞間足突互相接觸，10～14天分化成熟。RT-PCR、Western-blot、免疫熒光顯微鏡顯示，nephrin在33℃未分化足細(xì)胞和37℃分化足細(xì)胞中均有表達(dá)，37℃分

6、化足細(xì)胞中表達(dá)顯著增加(P＜0.01);Synaptopodin在33℃未分化足細(xì)胞中幾乎未見表達(dá)；而在37℃分化足細(xì)胞中表達(dá)明顯(P＜0.01)。GRα在33℃未分化足細(xì)胞和37℃分化足細(xì)胞中均有表達(dá)，37℃分化足細(xì)胞中表達(dá)顯著增加(P＜0.01)；qRT-PCR檢測顯示，mmu-miR-30a在33℃未分化足細(xì)胞和37℃分化足細(xì)胞中均有表達(dá)，37℃分化足細(xì)胞中表達(dá)顯著增加(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 GRα