抑制糖皮質激素受體(GR)表達建立腎陽虛小鼠模型.pdf

1、證型是中醫(yī)基礎理論和臨床應用的關鍵。由于腎在臟象學中居于重要地位，有關腎陽虛證的研究受到極大關注。為使腎虛證的研究更加客觀可控并具重復性，近幾十年來學術界一直關注腎陽虛證模型的研究。已有的研究發(fā)現(xiàn)腎陽虛患者下丘腦-垂體及其三個靶腺(腎上腺、甲狀腺、性腺)(Hypothalamic-pituitary-adrenocortical system，HPA)功能紊亂，溫陽補腎藥能特異性的提高下丘腦促皮質激素釋放激素(corticotropin

2、releasing hormone，CRH)水平，并能改善糖皮質激素對免疫抑制作用。HPA軸及其三個靶腺功能低下被認為是腎陽虛證的物質基礎，但HPA軸及其所屬三個靶腺涉及范圍非常廣泛，為便于臨床診斷和科學研究，必須找到簡單易測的客觀指標。研究表明糖皮質激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)是HPA軸中重要的激素受體，皮質醇必須與GR結合才能發(fā)揮生物效應，GR表達下調是否是腎陽虛證產生的原因之一呢?基于以上研究結

3、果我們提出以下假設：GR是腎陽虛證的觀察指標，抑制GR基因作為腎陽虛證的建模方法。
　　 目前抑制基因表達主要有以下幾種方法：基因敲除、RNA干擾、反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotides，AS-ODN)等。敲除動物GR基因會使GR在機體所有的組織、器官中幾乎完全喪失，動物多于出生后隨即死亡，或者胎死腹中，不能模擬腎陽虛證發(fā)生時的自然情況。RNA干擾技術能部分抑制特定基因表達，但是目前RNA干擾技術主要

4、用在細胞水平抑制特定基因表達，或者在短時間內抑制動物特定基因表達，不能達到長時間動物水平基因表達抑制的目的。AS-ODN也是抑制特定基因表達的手段之一，能達到較好的特定基因表達抑制的效果，但其半衰期短，不能用于長時期基因表達抑制。隨著緩釋技術的發(fā)展，AS-ODN技術和緩釋技術結合后能延長AS-ODN抑制基因表達的時間?？山到饩廴樗嵛⑶蚓褪蔷忈尲夹g中的一種。是否能將AS-ODN技術與可降解聚乳酸微球技術結合起來在動物水平達到較好的抑制GR

5、基因表達的目的?
　　 目的：
　　 1.制備載AS-ODN可降解聚乳酸微球，為建立GR表達抑制動物模型提供基礎。
　　 2.通過對三周齡C57小鼠皮下注射不同劑量載AS-ODN可降解聚乳酸微球，找出抑制GR基因表達效果最好的微球量。
　　 3.觀察GR表達抑制和腎陽虛證的相關性。
　　 方法：
　　 1.根據(jù)GR基因序列并參考文獻設計出AS-ODN序列及對應的正義寡核苷酸序列，采用復乳化

6、法冷凍干燥法制備載AS-ODN可降解聚乳酸微球。觀察微球形態(tài)、載藥率等監(jiān)測微球質量。
　　 2.應用不同劑量的載AS-ODN可降解微球皮下注射C57小鼠以建立GR基因敲低的腎陽虛小鼠模型，對該模型采用RT-PCR的方法進行鑒定，篩選出有效的用藥劑量，并用該劑量的可降解微球注射作為建立腎陽虛小鼠模型的方法。
　　 3.用溫補腎陽中藥干預GR表達抑制的C57小鼠，然后采用RT-PCR及Westernblot的方法分別驗證GR

7、在mRNA及蛋白水平的表達情況，以此來觀察溫陽補腎中藥是否能提高被抑制的GR表達水平。
　　 結果：
　　 通過復乳-溶劑揮發(fā)法制備載AS-ODN可降解聚乳酸微球，呈白色粉末狀，通過電鏡觀察其直徑在10～20μm，其外觀圓整。微球載藥量為6.0～11.5μg/mg之間。
　　 建立了GR表達抑制C57小鼠模型，各個載AS-ODN可降解微球劑量組GR mRNA在肝、腦、腎上腺中表達均降低。0.1mg載AS-ODN可

8、降解微球劑量組小鼠肝、腦、腎上腺組織中GRmRNA分別下調23％～26％，0.2 mg載AS-ODN可降解微球劑量組小鼠肝、腦、腎上腺組織中GRmRNA分別下調36％～43％，0.4 mg載AS-ODN可降解微球劑量組小鼠肝、腦、腎上腺組織中GRmRNA分別下調26％～41％，0.8 mg載AS-ODN可降解微球劑量組小鼠肝、腦、腎上腺組織中GRmRNA分別下調32％～40％。和空白對照組相比各個載AS-ODN可降解微球劑量組小鼠GRm

9、RNA表達均呈現(xiàn)下調趨勢，且和對照組相比下調有統(tǒng)計學意義。和對照組相比，經皮下注射載AS-ODN可降解聚乳酸微球一個月后，小鼠生長發(fā)育受到抑制，其體重增長緩慢，并在大體表現(xiàn)上體現(xiàn)出扎堆、豎毛等腎陽虛證外在表現(xiàn)，其中0.2mg劑量組小鼠體重增長最緩慢。
　　 采用載AS-ODN及正義寡核苷酸可降解微球對小鼠皮下注射一周后分別觀察GRmRNA表達和GR蛋白表達發(fā)現(xiàn)，和正義寡核苷酸可降解微球組相比，AS-ODN組小鼠GRmRNA表達和

10、GR蛋白表達均呈現(xiàn)下調趨勢。溫補腎陽中藥作用于GR表達抑制的C57小鼠后，GR在mRNA及蛋白水平的表達有提高作用。在AS-ODN可降解聚乳酸微球皮下注射一周后和對照組相比安慰劑干預組GRmRNA下調39％～41％，補。腎干預組下調37％～41％，兩者之間無明顯差異。
　　 在分別經過安慰劑干預一月和補腎中藥干預一月后安慰劑干預組GRmRNA下調34％～41％，補腎干預組GRmRNA下調10％～25％，經補腎干預后GRmRNA表

11、達上調。
　　 在蛋白表達方面呈現(xiàn)出相似的趨勢。在皮下注射載AS-ODN可降解聚乳酸微球一周后，安慰劑組GR蛋白表達下調52％～57％，補腎組GR蛋白表達下調54％～61％，在安慰劑干預一月后GR蛋白下調52％～61％，在補腎干預一月后GR蛋白表達下調16％～32％。
　　 在分別經過補腎干預和安慰劑干預一月后補腎組小鼠體重增長快于安慰劑干預組。補腎組抗應激能力也相應強于安慰劑組小鼠。
　　 結論：采用皮下注射載