AMPK信號通路在大鼠慢性糖皮質(zhì)激素應(yīng)激中的作用及機制.pdf

1、第一部分：糖皮質(zhì)激素對培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)細胞AMPK信號通路的影響及機制
　　目的:腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是機體重要的能量調(diào)節(jié)因子,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛分布。抑郁模型動物下丘腦AMPK磷酸化水平是降低的,而抑郁癥患者和動物模型均存在糖皮質(zhì)激素高表達。糖皮質(zhì)激素作用是否會下調(diào)AMPK磷酸化?尚未見相關(guān)研究報道。本實驗旨在通過給予大鼠和原代培養(yǎng)皮層細胞糖皮質(zhì)激素暴露,研究

2、該過程中AMPK的變化及其機制。
　　方法:皮下注射連續(xù)21d給予大鼠皮質(zhì)酮40mg/kg/d。分別給予原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元,小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞1μM地塞米松2h,48h或72h作用。通過Western Blot方法檢測蛋白水平的變化。
　　結(jié)果:慢性糖皮質(zhì)激素暴露降低大鼠海馬及前額皮層磷酸化AMPK(pAMPK)水平。給予地塞米松作用2h,48h,72h均不影響神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞的pAMPK水平。給予地塞米松作用2h,

3、48h和72h降低星形膠質(zhì)細胞pAMPK水平。給予皮質(zhì)酮作用2h,48h和72h也降低星形膠質(zhì)細胞pAMPK水平。給予星形膠質(zhì)細胞地塞米松2h,48h和72h升高p(Thr32)FOXO3a水平。血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶1(serum-and glucocorticoid-inducible kinase 1,SGK1)抑制劑GSK650394可抑制地塞米松導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細胞pAMPK降低和p(Thr32)FOXO3a升高。但糖皮質(zhì)

4、激素受體(glucocorticoid receptor,GR)拮抗劑RU38486不能阻斷地塞米松導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細胞pAMPK降低。而且給予GSK650394可逆轉(zhuǎn)地塞米松導(dǎo)致的p(T32)FOXO3a升高和pAMPK下降。
　　結(jié)論:地塞米松通過激活SGK1抑制FOXO3a轉(zhuǎn)錄活性,減少LKB1表達,選擇性地抑制星形膠質(zhì)細胞的pAMPK水平。
　　第二部分：AMPK對培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細胞糖皮質(zhì)激素受體表達的影響及機制

5、r>　　目的:有研究表明慢性糖皮質(zhì)激素暴露可降低動物大腦GR表達。給予糖皮質(zhì)激素可抑制星形膠質(zhì)細胞pAMPK。有報道,外周AMPK可以調(diào)節(jié)GR功能,但未見中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)研究報道。本實驗旨在研究地塞米松作用于原代培養(yǎng)皮層星形膠質(zhì)細胞該過程中,AMPK信號通路介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素受體表達下調(diào)中的作用及機制。
　　方法:給予原代培養(yǎng)皮層星形膠質(zhì)細胞1μM地塞米松作用2h,48h或72h;通過Western Blot方法檢測

6、各蛋白水平的變化。
　　結(jié)果:給予地塞米松2h,48h或72h不影響神經(jīng)元GR表達。給予地塞米松48h或72h降低小膠質(zhì)細胞GR和iNOS表達。給予地塞米松48h或72h可降低星形膠質(zhì)細胞GR,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF)表達,增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表達。給予皮質(zhì)酮48h或72h可降低星

7、形膠質(zhì)細胞GR,BDNF表達。在星形膠質(zhì)細胞,AMPK抑制劑compound C,Ara-A48h和72h均減少GR和BDNF的表達;給予AMPK激動劑AICAR,阿司匹林和二甲雙胍可逆轉(zhuǎn)地塞米松導(dǎo)致的GR和BDNF的表達下降;SGK1抑制劑GSK650394也可阻斷或逆轉(zhuǎn)地塞米松導(dǎo)致的GR和BDNF的表達下降。GR阻斷劑RU38486不能阻斷地塞米松的作用;AMPK激動劑AICAR,阿司匹林和二甲雙胍均可逆轉(zhuǎn)地塞米松導(dǎo)致的GR和BDN

8、F表達變化;地塞米松暴露可以導(dǎo)致FOXO3a抑制性位點Thr32磷酸化水平升高;地塞米松暴露可以導(dǎo)致組蛋白去乙?；?(Histone deacetylases 5,HDAC5)位點S295和S498磷酸化水平升高,而且AICAR可以逆轉(zhuǎn)該變化;HDAC5抑制劑SAHA和SB939均可以阻斷和逆轉(zhuǎn)地塞米松導(dǎo)致的GR和BDNF下降;SGK1抑制劑可以阻斷和逆轉(zhuǎn)地塞米松導(dǎo)致GR和BDNF變化。
　　結(jié)論:地塞米松通過抑制AMPK對HD

9、AC5的磷酸化,增加HDAC5活性,從而降低星形膠質(zhì)細胞GR的表達。
　　第三部分：AMPK激動劑二甲雙胍對慢性糖皮質(zhì)激素暴露所致大鼠抑郁樣行為的作用及機制
　　目的:AMPK激動劑阿司匹林,白藜蘆醇有一定的抗抑郁作用。很多抗糖尿病藥物也可緩解抑郁癥狀。但是,上述作用機制并不明確?？固悄虿∷幬锒纂p胍是AMPK激動劑,少見其抗抑郁報道。本實驗旨在通過慢性糖皮質(zhì)激素暴露大鼠,探討二甲雙胍對慢性糖皮質(zhì)激素暴露導(dǎo)致大鼠抑郁樣行為及

10、GR表達下降的影響和作用機制。
　　方法:給予大鼠連續(xù)21d皮下注射皮質(zhì)酮40mg/kg/d,第15d開始,同時給予300mg/kg/d二甲雙胍或氟西汀10mg/kg/d連續(xù)14d;采用強迫游泳評估大鼠抑郁樣行為;采用高架十字迷宮評估大鼠焦慮樣行為;采用高爾基染色方法檢測樹突棘密度;采用Western Blot方法檢測大鼠腦區(qū)蛋白水平的變化。
　　結(jié)果:慢性皮質(zhì)酮暴露大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為增加和體重增長下降,焦慮樣行為無變化;海