糖皮質(zhì)激素調(diào)控L02細(xì)胞P-gp表達(dá)的分子機(jī)制.pdf

1、糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid, GC)普遍存在于人體，是腎上腺皮質(zhì)合成和分泌的類固醇激素。目前，人工合成的糖皮質(zhì)激素廣泛應(yīng)用于疾病的治療。我們的前期研究和日本學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，在乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)相關(guān)的病例中，糖皮質(zhì)激素能夠有效阻止急性肝衰竭的發(fā)生，但糖皮質(zhì)激素在治療此類疾病中的確切機(jī)制尚未完全闡明。而由多藥耐藥基因1(multi-drug resistance gene1，MDR1)編

2、碼的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)廣泛存在于人血腦屏障、血胎盤屏障、肝細(xì)胞、腸上皮組織等，是細(xì)胞膜上的多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠增強(qiáng)肝細(xì)胞的保護(hù)功能，而決定肝細(xì)胞存活與否的關(guān)鍵在于肝細(xì)胞損傷與肝細(xì)胞保護(hù)。有研究顯示，糖皮質(zhì)激素能夠誘導(dǎo)不同細(xì)胞的P-gp增強(qiáng)表達(dá)，因此推測(cè)糖皮質(zhì)激素可能通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞P-gp增強(qiáng)表達(dá)，繼而增強(qiáng)肝細(xì)胞保護(hù)功能，阻止急性肝衰竭的發(fā)生。還有研究顯示，糖皮質(zhì)激素能激活磷酸肌醇-3激酶(PI3K)/

3、蛋白激酶B(Akt)、NF-κB、人孕烷X受體(PXR)等細(xì)胞信號(hào)通路，而這些細(xì)胞信號(hào)通路在多種細(xì)胞中參與調(diào)控P-gp的表達(dá)，因此推測(cè)糖皮質(zhì)激素能夠通過PI3K/Akt、NF-κB、PXR等細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控L02細(xì)胞P-gp的表達(dá)。
　　研究目的：
　　在本研究中，我們體外培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞株，探討地塞米松對(duì)人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞株P(guān)-gp表達(dá)的影響，及細(xì)胞信號(hào)通路PI3K/Akt、NF-κB、PXR在其中所起的作用

4、。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量Real time qPCR(SYBR)、Western-blot、RNA干擾等技術(shù)進(jìn)行分析研究，從而闡明糖皮質(zhì)激素在調(diào)控L02細(xì)胞P-gp表達(dá)中的作用與初步分子機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.體外培養(yǎng)類人正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞，設(shè)立正常對(duì)照后，使用不同濃度的地塞米松處理24h，收集實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組細(xì)胞，并提取細(xì)胞總RNA、總蛋白。
　　2.Real time qPCR(SYBR)檢測(cè)不同濃度地塞米

5、松處理24h后的類人正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞、正常對(duì)照組細(xì)胞的MDR1 mRNA。
　　3.Western-blot檢測(cè)不同濃度地塞米松處理24h后的類人正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞和正常對(duì)照組細(xì)胞的P-gp、Akt、NF-κB蛋白表達(dá)水平。
　　4.體外培養(yǎng)類人正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞，設(shè)立正常對(duì)照，分別及聯(lián)合使用蛋白酶抑制劑LY294002、PDTC和地塞米松處理類人正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞24h，收集實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組細(xì)胞，用于總

6、RNA、總蛋白等提取。
　　5.Real time qPCR(SYBR)檢測(cè)分別及聯(lián)合使用蛋白酶抑制劑LY294002、PDTC和地塞米松處理組、正常對(duì)照組細(xì)胞的MDR1 mRNA。
　　6.Western-blot檢測(cè)分別及聯(lián)合使用蛋白酶抑制劑LY294002、PDTC和地塞米松處理組、正常對(duì)照組細(xì)胞P-gp、Akt和NF-κB蛋白表達(dá)水平。
　　7.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染針對(duì)人PXR的siRNA和非針對(duì)人PXR的Control

7、siRNA至類人正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后使用地塞米松處理24h，收集實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞，用于總RNA、總蛋白等提取。
　　8.Real time qPCR(SYBR)檢測(cè)針對(duì)人PXR的siRNA和非針對(duì)人PXR的ControlsiRNA轉(zhuǎn)染處理組、正常對(duì)照組細(xì)胞的MDR1 mRNA。
　　9.Western-blot檢測(cè)針對(duì)人PXR的siRNA和非針對(duì)人PXR的Control siRNA轉(zhuǎn)染處理組、正常對(duì)照組

8、細(xì)胞的P-gp蛋白表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果：
　　1.10μM地塞米松刺激24h后類人正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞的MDR1 mRNA表達(dá)水平較刺激前顯著增加36.3％(P=0.0004)。
　　2.10μM地塞米松刺激24h后類人正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞P-gp、Akt、NF-κB表達(dá)水平較刺激前分別顯著增加60.8％(P=0.0267)、25.0％(P=0.0358)和24.1％(P=0.0026)。
　　3.類人正

9、常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞中P-gp與Akt的表達(dá)水平之間呈顯著正相關(guān)（Pearson系數(shù)=0.87，P＜0.01）;P-gp與NF-κB之間呈顯著正相關(guān)(Pearson系數(shù)=0.722，P＜0.01)。
　　4.LY294002(20μM)處理組P-gp表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著降低33.8％(P=0.0184)，MDR1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低81.0％（P＜0.0001）;PDTC(30μM)處理組P-gp表達(dá)水平較正常對(duì)

10、照組顯著降低36.3％（P=0.0018），MDR1mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低69.0％（P＜0.0001）。
　　5.單獨(dú)使用地塞米松處理組和聯(lián)合地塞米松與LY294002處理組的L02細(xì)胞P-gp表達(dá)水平分別是正常對(duì)照組的（163.5士18.4）％和（130.1±22.0）％，兩者間相差顯著（P=0.0313）;單獨(dú)使用地塞米松處理組和聯(lián)合地塞米松與PDTC處理組的L02細(xì)胞P-gp表達(dá)水平分別是正常對(duì)照組的（150.7

11、±9.8）％和（123.7±3.9）％，兩者間相差顯著（P=0.0423）。
　　6.聯(lián)合地塞米松與LY294002處理組的L02細(xì)胞MDR1 mRNA表達(dá)水平較單獨(dú)使用地塞米松處理組顯著降低92.7％（P＜0.0001）;聯(lián)合地塞米松與PDTC處理組的L02細(xì)胞MDR1 mRNA表達(dá)水平較單獨(dú)使用地塞米松處理組顯著降低59.0％(P＜0.0001)。
　　7.使用針對(duì)人PXR的siRNA轉(zhuǎn)染處理組較使用非針對(duì)人PXR的Co

12、ntrol siRNA轉(zhuǎn)染處理組的L02細(xì)胞P-gp表達(dá)水平顯著降低58.4％(P=0.0039)。
　　8.使用針對(duì)人PXR的siRNA轉(zhuǎn)染處理組較使用非針對(duì)人PXR的Control siRNA轉(zhuǎn)染處理組的L02細(xì)胞MDR1 mRNA表達(dá)水平顯著降低86.0％(P＜0.0001)。
　　研究結(jié)論：
　　糖皮質(zhì)激素能夠誘導(dǎo)類人正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞MDR1 mRNA與P-gp增強(qiáng)表達(dá)，提示糖皮質(zhì)激素可能通過上調(diào)肝細(xì)胞的