ZIC1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞周期和細(xì)胞遷移的影響及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、我們前期采用cDNA微陣列分析(cDNAmicroarray)和啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ZIC1(Zincfingerofthecerebellum1)基因在胃腸癌細(xì)胞和組織中沉默表達(dá)或顯著表達(dá)顯著下調(diào)，這種低表達(dá)現(xiàn)象與啟動(dòng)子高甲基化相關(guān)。ZIC1基因是ZIC基因家族成員之一，定位于人類(lèi)3號(hào)染色體長(zhǎng)臂，具有三個(gè)外顯子結(jié)構(gòu)和Cys2His2鋅指結(jié)構(gòu)域，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是重要的C末端鋅指轉(zhuǎn)錄因子。近年來(lái)的研究表明，ZIC1基因除了在神經(jīng)嵴和腦發(fā)育過(guò)程起

2、重要作用外，還與髓母細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜癌、硬纖維瘤和脂肪肉瘤等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但有關(guān)ZIC1基因?qū)ξ赴┠[瘤生物學(xué)行為的影響和相關(guān)分子機(jī)制未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵作用。已經(jīng)證實(shí)Sonichedgehog(Shh)信號(hào)通路與胃癌的發(fā)病機(jī)制聯(lián)系密切，可以調(diào)控胃癌細(xì)胞的分化和增殖。MAPK和PI3K信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞增殖的重要信號(hào)通路，這兩條信號(hào)通路的激活還參與細(xì)胞周期特別是G1-S期的調(diào)控

3、。
　　 本課題采用現(xiàn)代細(xì)胞與分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)建立外源性過(guò)表達(dá)ZIC1的胃癌細(xì)胞系，了解胃癌發(fā)生中ZIC1基因?qū)?xì)胞增殖、細(xì)胞遷移及細(xì)胞侵襲等重要生物學(xué)功能的影響，并進(jìn)一步探討ZIC1對(duì)胃癌發(fā)生中MAPK、PI3K和Shh信號(hào)通路的分子調(diào)控機(jī)制。同時(shí)采用基因芯片技術(shù)對(duì)ZIC1下游相關(guān)靶基因進(jìn)行系統(tǒng)篩選，并對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行驗(yàn)證以明確其對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移的作用機(jī)制。
　　 方法和材料：
　　 1.將胃癌細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)

4、染pCDNA3.1和pCDNA3.1-ZIC1載體后，采用MTS及Transwell試驗(yàn)檢測(cè)ZIC1對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為(細(xì)胞增殖、遷移及侵襲)的影響。
　　 2.采用流式細(xì)胞儀分析過(guò)表達(dá)ZIC1后胃癌細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化，采用Westernblot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(p21，p27，cyclinD1)和細(xì)胞增殖MAPK、PI3K信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白(Akt，Erk1/2)的變化。
　　 3.通過(guò)建立外源性過(guò)表達(dá)ZIC

5、1胃癌細(xì)胞株，探討其對(duì)Shh蛋白表達(dá)的影響；進(jìn)一步利用Cyclopamine阻斷Shh信號(hào)通路，研究對(duì)細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白(p21，cyclinD1)的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞遷移的影響。
　　 4.MKN28細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCDNA3.1空白載體和pCDNA3.1-ZIC1后，分別收集RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)篩選ZIC1可能的下游調(diào)控基因，并對(duì)其中三個(gè)基因CDKN2B，TP53INP1，ARHGAP進(jìn)行Q-PCR

6、驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：
　　 1.過(guò)表達(dá)ZIC1可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。過(guò)表達(dá)ZIC1后BGC823胃癌細(xì)胞增殖在第1天和第3天顯著減慢(p<0.001)。過(guò)表達(dá)ZIC1后AGS，BGC823和SGC7901細(xì)胞遷移數(shù)量顯著減少(p<0.001)；過(guò)表達(dá)ZIC1后AGS細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯下降(p<0.05)。
　　 2.ZIC1可顯著抑制MAPK和PI3K信號(hào)通路，進(jìn)一步調(diào)控了關(guān)鍵細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。外源

7、性過(guò)表達(dá)ZIC1后AGS和SGC7901胃癌細(xì)胞在細(xì)胞周期G1期DNA的含量增多，而S期DNA含量相應(yīng)降低。胃癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)ZIC1可顯著上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21，p27的表達(dá)，同時(shí)抑制cyclinD1表達(dá)。過(guò)表達(dá)ZIC1后AGS，MKN28，BGC823和SGC7901細(xì)胞株的p-Erk1/2和p-Akt活性蛋白表達(dá)明顯降低，而總蛋白Erk1/2和Akt無(wú)明顯改變。
　　 3.ZIC1對(duì)胃癌細(xì)胞周期蛋白和胃癌細(xì)胞遷移的調(diào)控可能

8、與抑制Shh信號(hào)通路有關(guān)。過(guò)表達(dá)ZIC1后胃癌細(xì)胞株SHHmRNA的表達(dá)明顯下降(p<0.01)，Shh蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。Cyclopamine藥物處理抑制Shh信號(hào)通路后胃癌細(xì)胞ZIC1mRNA表達(dá)水平未見(jiàn)明顯變化，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21表達(dá)上調(diào)，cyclinD1表達(dá)下調(diào)。另外，Transwell遷移試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cyclopamine藥物處理后胃癌細(xì)胞遷移數(shù)量顯著減少(p<0.001)。
　　 4.篩選和驗(yàn)證胃癌細(xì)胞ZIC1調(diào)

9、控下游候選基因。通過(guò)人類(lèi)全基因組芯片篩選出ZIC1下調(diào)下游基因132個(gè)，上調(diào)基因66個(gè)，功能歸類(lèi)分析顯示差異基因主要參與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等。挑選代表性基因CDKN2B，ARHGAP9，TP53INP1進(jìn)行Q-PCR驗(yàn)證，結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果基本相符。
　　 結(jié)論：
　　 1.過(guò)表達(dá)ZIC1抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。
　　 2.過(guò)表達(dá)ZIC1顯著抑制Akt、Erk1/2磷酸化水平

10、，進(jìn)一步調(diào)控了關(guān)鍵細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21，p27和cyclinD1的表達(dá)，從而調(diào)控胃癌細(xì)胞周期G1/S檢測(cè)點(diǎn)。
　　 3.過(guò)表達(dá)ZIC1抑制胃癌細(xì)胞Shh的表達(dá)水平。通路抑制劑阻斷Shh下游分子可以影響胃癌細(xì)胞p21和cyclinD1表達(dá)，并抑制細(xì)胞遷移。ZIC1對(duì)胃癌細(xì)胞周期蛋白和胃癌細(xì)胞遷移的調(diào)控可能與抑制Shh信號(hào)通路有關(guān)。
　　 4.ZIC1可能通過(guò)調(diào)控胃癌細(xì)胞周期、增殖、遷移和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等相關(guān)下游功能基因，從而發(fā)