Polo-like激酶1在肺癌細胞周期調(diào)控中的作用及其機制探討.pdf

1、有關(guān)腫瘤細胞周期的研究不斷揭示腫瘤的發(fā)生與周期異常關(guān)系密切，甚至有學者提出腫瘤即為一種周期?。阂驗槿狈φ５闹芷谡{(diào)控蛋白和檢測點的監(jiān)督機制，導致細胞的惡性轉(zhuǎn)化和增生，并出現(xiàn)凋亡障礙，從而使其獲得無限增殖的能力，最終形成腫瘤組織。但腫瘤細胞如何“逃脫”周期檢測點監(jiān)控的分子機制尚未完全闡明。Polo-like激酶1(Plk1)是存在于哺乳動物細胞中的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是參與細胞周期運行的重要分子，在有絲分裂的進入、中心體的成熟、紡錘體的組

2、裝和胞質(zhì)分裂中發(fā)揮重要作用；Plk1亦是周期檢測點信號傳導中的重要分子。近年來的研究顯示在許多人類腫瘤中Plk1均呈高表達狀態(tài)，并與腫瘤的分期和預后相關(guān)聯(lián)。提示Plk1可作為腫瘤標記物，在病情進展和預后方面提供依據(jù)。同時，以Plk1為靶點的基因治療也獲得了令人欣喜的結(jié)果。新近研究還認為Plk1可能參與腫瘤的起源以及發(fā)生發(fā)展的過程，但有關(guān)Plk1自身的活性調(diào)節(jié)和信號通路至今未明。因此，明確Plk1在腫瘤細胞周期運行中的作用及其分子機制將為

3、揭示腫瘤起源提供新視點，并有助于探尋防治腫瘤的新的藥物和手段。本實驗利用反義RNA和RNA干擾技術(shù)，觀察Plk1基因表達下調(diào)對肺癌細胞增殖和周期運行的影響，并對其作用機制和信號傳導通路進行初步探討。 第一部分:反義RNA分子對A549細胞增殖和周期運行的影響。培養(yǎng)肺腺癌細胞系A549，構(gòu)建表達Plk1反義RNA的質(zhì)粒pcDNA3-Plk1并轉(zhuǎn)入A549細胞，以轉(zhuǎn)染pcDNA3空質(zhì)粒的細胞作為陰性對照，以未轉(zhuǎn)染的細胞為空白對照。首

4、先觀察反義RNA的轉(zhuǎn)染對Plk1基因和蛋白表達的影響。結(jié)果：A549細胞轉(zhuǎn)染pcDAN3-Plk1后，Plk1mRNA的表達較對照組顯著下降(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染24h后Plk1mRNA的表達下降46.75％，轉(zhuǎn)染48h后下降61.84％。蛋白表達的變化與此類似。表明反義RNA能在A549細胞內(nèi)特異性地降解Plk1基因的表達。 緊接著實驗觀察了反義RNA對A549細胞增殖、周期分布和對化療藥物敏感性的的影響。(1)細胞計數(shù)的結(jié)果

5、顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3-Plk1后48h，存活的A549細胞數(shù)明顯低于轉(zhuǎn)染pcDNA3組的細胞和對照細胞(P＜0.05)。(2)流式細胞術(shù)細胞周期分析顯示轉(zhuǎn)染pcDAN3-Plk1后48h，S期細胞減少(P＜0.05)，G2/M細胞增多(P＜0.05)，并有亞G1峰形成；至轉(zhuǎn)染后72h，亞G1峰值明顯升高，提示轉(zhuǎn)染細胞發(fā)生G2/M期阻滯和凋亡。BrdU脈沖標記的結(jié)果與流式結(jié)果基本一致。(3)轉(zhuǎn)染pcDNA3-Plk1組中諾維本的IC50

6、值明顯低于其它組，說明反義RNA能增加A549細胞對諾維本的敏感性。 其次，為分析A549細胞凋亡的具體途徑，檢測了凋亡效應蛋白caspase8、9和3的表達，結(jié)果顯示在反義RNA誘導A549凋亡的過程中存在caspase8和caspase3的激活，而caspase9的表達無變化。這提示受體介導的凋亡途徑可能在此過程中起主導作用。 最后，為分析Plk1表達降低后對有絲分裂紡錘體組裝的影響，采用免疫熒光技術(shù)檢測α微管蛋白的

7、表達。結(jié)果顯示分裂細胞核周邊缺乏微管的聚集，或形成單極的紡錘體。提示Plk1削減后干擾微管的聚集，影響有絲分裂紡錘體的正常裝配。 由上述結(jié)果可見：(1)反義RNA能抑制A549細胞中Plk1的表達，引起A549細胞G2/M期阻滯和凋亡，抑制細胞增殖，并增加細胞對化療藥物的敏感性。(2)Plk1表達下調(diào)后活性減弱，影響微管蛋白的聚合和紡錘體的正常裝配。 第二部分:RNA干擾技術(shù)抑制Polo-Like激酶1表達對A549細胞

8、的影響。RNA干擾技術(shù)具有序列和結(jié)構(gòu)特異性，可克服反義RNA策略中存在的問題，如寡聚物易被降解、細胞攝取率低、非特異性的阻斷等。RNA干擾還具有省時、見效快的特點。為進一步說明Plk1的表達降低對A549細胞的影響，利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建能產(chǎn)生siRNA的質(zhì)粒載體psiRNA-hH1-Plk1并導入A549細胞中。采用RT-PCR檢測Plk1mRNA表達的變化，Western-blot檢測Plk1、cyclinB1、p53蛋白的表達變

9、化，流式細胞術(shù)分析細胞周期變化和凋亡；免疫熒光染色檢測α微管蛋白的表達。以此觀察RNA干擾能否有效抑制Plk1的表達水平，以及抑制后對Plk1功能和對A549細胞生長的影響。結(jié)果表明，psiRNA-hH1-Plk1質(zhì)粒能特異性地抑制Plk1基因的表達并使其活性下降，cyclinB1及p53蛋白的表達水平升高，微管聚集障礙或形成單極的紡錘體，A549細胞增殖減慢，出現(xiàn)G2/M期阻滯并存在細胞凋亡。與反義RNA相比，siRNA更有效的抑制了

10、A549細胞的生長，針對Plk1基因的RNA干擾有望用于腫瘤的基因治療。 第三部分:氯化鋰對A549細胞增殖的影響及其與Polo-like激酶1的功能相關(guān)性研究。為分析糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制劑氯化鋰(LiCl)對A549細胞增殖和周期運行中的影響，用不同濃度的LiCl(0～50mmol/L)分別處理A549細胞24h或48h，首先觀察細胞生長特性的變化和增殖情況。結(jié)果：(1)相差顯微鏡下，LiCl處理24h后細胞形態(tài)無

11、明顯變化。10mmol/L處理48h后，細胞融合減慢，形態(tài)變扁并呈多角型，細胞間隙增寬，而正常對照細胞呈梭形、細胞間連接緊密。(2)細胞計數(shù)表明10mmol/L的LiCl作用48h后細胞增殖減慢(與對照組相比，P＜0.05)，而CCK-8的結(jié)果提示20mmol/LLiCl才能抑制細胞增殖，10mmol/LLiCl則無明顯影響(P＞0.05)。(3)流式細胞術(shù)細胞周期分析顯示，LiCl處理24h后，細胞周期無明顯改變；48h后，10mmo

12、l/L組G2/M期細胞稍增多(P＞0.05)，而20mmol/L組G2/M期細胞明顯增多(P＜0.05)，提示出現(xiàn)G2/M期阻滯；S期細胞數(shù)則有顯著降低(P＜0.05)。有關(guān)周期相關(guān)蛋白的檢測可見LiCl處理48h后p53和Plk1表達增多，而cyclinB1表達無變化。RT-PCR檢測表明LiCl處理24h后，Plk1mRNA的表達即有增高，延長其作用時間或加大LiCl的濃度并不能顯著增加Plk1mRNA的表達。 為分析LiC

13、l處理對Plk1啟動子活性的影響，瞬時轉(zhuǎn)染Plk1熒光素酶報告基因質(zhì)粒，再加20mmol/LLiCl處理24h和48h，結(jié)果顯示LiCl作用后24h，pGL2-Plk1的熒光素酶活性即有升高，與對照組比較差異無顯著性(P＞0.05)；至48h時，pGL2-Plk1的熒光素酶活性明顯增加(P＜0.05)，提示Plk1的轉(zhuǎn)錄活性增強。由上述結(jié)果可見：(1)LiCl導致A549細胞G2/M期阻滯，抑制細胞增殖；(2)LiCl促進Plk1的啟動

14、子活性，增強Plk1的轉(zhuǎn)錄。 本實驗提示:GSK3可能是Plk1的負調(diào)控因子，在維系Plk1的正常功能方面發(fā)揮作用。 小結(jié)細胞凋亡和細胞增殖的協(xié)同(CoordinationofApoptosisandProliferation,CAP)是現(xiàn)今腫瘤研究領域的熱點。Polo-like激酶1正是參與這兩方面的重要分子。隨著對Polo-like激酶家族研究的不斷深入，Plk1在細胞周期調(diào)控、細胞增殖和凋亡方面的作用日益清晰。本實