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1、有關(guān)腫瘤細(xì)胞周期的研究不斷揭示腫瘤的發(fā)生與周期異常關(guān)系密切,甚至有學(xué)者提出腫瘤即為一種周期?。阂?yàn)槿狈φ5闹芷谡{(diào)控蛋白和檢測(cè)點(diǎn)的監(jiān)督機(jī)制,導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和增生,并出現(xiàn)凋亡障礙,從而使其獲得無(wú)限增殖的能力,最終形成腫瘤組織。但腫瘤細(xì)胞如何“逃脫”周期檢測(cè)點(diǎn)監(jiān)控的分子機(jī)制尚未完全闡明。Polo-like激酶1(Plk1)是存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的絲/蘇氨酸蛋白激酶,是參與細(xì)胞周期運(yùn)行的重要分子,在有絲分裂的進(jìn)入、中心體的成熟、紡錘體的組
2、裝和胞質(zhì)分裂中發(fā)揮重要作用;Plk1亦是周期檢測(cè)點(diǎn)信號(hào)傳導(dǎo)中的重要分子。近年來(lái)的研究顯示在許多人類(lèi)腫瘤中Plk1均呈高表達(dá)狀態(tài),并與腫瘤的分期和預(yù)后相關(guān)聯(lián)。提示Plk1可作為腫瘤標(biāo)記物,在病情進(jìn)展和預(yù)后方面提供依據(jù)。同時(shí),以Plk1為靶點(diǎn)的基因治療也獲得了令人欣喜的結(jié)果。新近研究還認(rèn)為Plk1可能參與腫瘤的起源以及發(fā)生發(fā)展的過(guò)程,但有關(guān)Plk1自身的活性調(diào)節(jié)和信號(hào)通路至今未明。因此,明確Plk1在腫瘤細(xì)胞周期運(yùn)行中的作用及其分子機(jī)制將為
3、揭示腫瘤起源提供新視點(diǎn),并有助于探尋防治腫瘤的新的藥物和手段。本實(shí)驗(yàn)利用反義RNA和RNA干擾技術(shù),觀察Plk1基因表達(dá)下調(diào)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和周期運(yùn)行的影響,并對(duì)其作用機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行初步探討。 第一部分:反義RNA分子對(duì)A549細(xì)胞增殖和周期運(yùn)行的影響。培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549,構(gòu)建表達(dá)Plk1反義RNA的質(zhì)粒pcDNA3-Plk1并轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞,以轉(zhuǎn)染pcDNA3空質(zhì)粒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照,以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為空白對(duì)照。首
4、先觀察反義RNA的轉(zhuǎn)染對(duì)Plk1基因和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDAN3-Plk1后,Plk1mRNA的表達(dá)較對(duì)照組顯著下降(P<0.05),轉(zhuǎn)染24h后Plk1mRNA的表達(dá)下降46.75%,轉(zhuǎn)染48h后下降61.84%。蛋白表達(dá)的變化與此類(lèi)似。表明反義RNA能在A549細(xì)胞內(nèi)特異性地降解Plk1基因的表達(dá)。 緊接著實(shí)驗(yàn)觀察了反義RNA對(duì)A549細(xì)胞增殖、周期分布和對(duì)化療藥物敏感性的的影響。(1)細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果
5、顯示,轉(zhuǎn)染pcDNA3-Plk1后48h,存活的A549細(xì)胞數(shù)明顯低于轉(zhuǎn)染pcDNA3組的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞(P<0.05)。(2)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期分析顯示轉(zhuǎn)染pcDAN3-Plk1后48h,S期細(xì)胞減少(P<0.05),G2/M細(xì)胞增多(P<0.05),并有亞G1峰形成;至轉(zhuǎn)染后72h,亞G1峰值明顯升高,提示轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯和凋亡。BrdU脈沖標(biāo)記的結(jié)果與流式結(jié)果基本一致。(3)轉(zhuǎn)染pcDNA3-Plk1組中諾維本的IC50
6、值明顯低于其它組,說(shuō)明反義RNA能增加A549細(xì)胞對(duì)諾維本的敏感性。 其次,為分析A549細(xì)胞凋亡的具體途徑,檢測(cè)了凋亡效應(yīng)蛋白caspase8、9和3的表達(dá),結(jié)果顯示在反義RNA誘導(dǎo)A549凋亡的過(guò)程中存在caspase8和caspase3的激活,而caspase9的表達(dá)無(wú)變化。這提示受體介導(dǎo)的凋亡途徑可能在此過(guò)程中起主導(dǎo)作用。 最后,為分析Plk1表達(dá)降低后對(duì)有絲分裂紡錘體組裝的影響,采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)α微管蛋白的
7、表達(dá)。結(jié)果顯示分裂細(xì)胞核周邊缺乏微管的聚集,或形成單極的紡錘體。提示Plk1削減后干擾微管的聚集,影響有絲分裂紡錘體的正常裝配。 由上述結(jié)果可見(jiàn):(1)反義RNA能抑制A549細(xì)胞中Plk1的表達(dá),引起A549細(xì)胞G2/M期阻滯和凋亡,抑制細(xì)胞增殖,并增加細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。(2)Plk1表達(dá)下調(diào)后活性減弱,影響微管蛋白的聚合和紡錘體的正常裝配。 第二部分:RNA干擾技術(shù)抑制Polo-Like激酶1表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞
8、的影響。RNA干擾技術(shù)具有序列和結(jié)構(gòu)特異性,可克服反義RNA策略中存在的問(wèn)題,如寡聚物易被降解、細(xì)胞攝取率低、非特異性的阻斷等。RNA干擾還具有省時(shí)、見(jiàn)效快的特點(diǎn)。為進(jìn)一步說(shuō)明Plk1的表達(dá)降低對(duì)A549細(xì)胞的影響,利用RNA干擾技術(shù),構(gòu)建能產(chǎn)生siRNA的質(zhì)粒載體psiRNA-hH1-Plk1并導(dǎo)入A549細(xì)胞中。采用RT-PCR檢測(cè)Plk1mRNA表達(dá)的變化,Western-blot檢測(cè)Plk1、cyclinB1、p53蛋白的表達(dá)變
9、化,流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期變化和凋亡;免疫熒光染色檢測(cè)α微管蛋白的表達(dá)。以此觀察RNA干擾能否有效抑制Plk1的表達(dá)水平,以及抑制后對(duì)Plk1功能和對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明,psiRNA-hH1-Plk1質(zhì)粒能特異性地抑制Plk1基因的表達(dá)并使其活性下降,cyclinB1及p53蛋白的表達(dá)水平升高,微管聚集障礙或形成單極的紡錘體,A549細(xì)胞增殖減慢,出現(xiàn)G2/M期阻滯并存在細(xì)胞凋亡。與反義RNA相比,siRNA更有效的抑制了
10、A549細(xì)胞的生長(zhǎng),針對(duì)Plk1基因的RNA干擾有望用于腫瘤的基因治療。 第三部分:氯化鋰對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響及其與Polo-like激酶1的功能相關(guān)性研究。為分析糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制劑氯化鋰(LiCl)對(duì)A549細(xì)胞增殖和周期運(yùn)行中的影響,用不同濃度的LiCl(0~50mmol/L)分別處理A549細(xì)胞24h或48h,首先觀察細(xì)胞生長(zhǎng)特性的變化和增殖情況。結(jié)果:(1)相差顯微鏡下,LiCl處理24h后細(xì)胞形態(tài)無(wú)
11、明顯變化。10mmol/L處理48h后,細(xì)胞融合減慢,形態(tài)變扁并呈多角型,細(xì)胞間隙增寬,而正常對(duì)照細(xì)胞呈梭形、細(xì)胞間連接緊密。(2)細(xì)胞計(jì)數(shù)表明10mmol/L的LiCl作用48h后細(xì)胞增殖減慢(與對(duì)照組相比,P<0.05),而CCK-8的結(jié)果提示20mmol/LLiCl才能抑制細(xì)胞增殖,10mmol/LLiCl則無(wú)明顯影響(P>0.05)。(3)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期分析顯示,LiCl處理24h后,細(xì)胞周期無(wú)明顯改變;48h后,10mmo
12、l/L組G2/M期細(xì)胞稍增多(P>0.05),而20mmol/L組G2/M期細(xì)胞明顯增多(P<0.05),提示出現(xiàn)G2/M期阻滯;S期細(xì)胞數(shù)則有顯著降低(P<0.05)。有關(guān)周期相關(guān)蛋白的檢測(cè)可見(jiàn)LiCl處理48h后p53和Plk1表達(dá)增多,而cyclinB1表達(dá)無(wú)變化。RT-PCR檢測(cè)表明LiCl處理24h后,Plk1mRNA的表達(dá)即有增高,延長(zhǎng)其作用時(shí)間或加大LiCl的濃度并不能顯著增加Plk1mRNA的表達(dá)。 為分析LiC
13、l處理對(duì)Plk1啟動(dòng)子活性的影響,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Plk1熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,再加20mmol/LLiCl處理24h和48h,結(jié)果顯示LiCl作用后24h,pGL2-Plk1的熒光素酶活性即有升高,與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05);至48h時(shí),pGL2-Plk1的熒光素酶活性明顯增加(P<0.05),提示Plk1的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。由上述結(jié)果可見(jiàn):(1)LiCl導(dǎo)致A549細(xì)胞G2/M期阻滯,抑制細(xì)胞增殖;(2)LiCl促進(jìn)Plk1的啟動(dòng)
14、子活性,增強(qiáng)Plk1的轉(zhuǎn)錄。 本實(shí)驗(yàn)提示:GSK3可能是Plk1的負(fù)調(diào)控因子,在維系Plk1的正常功能方面發(fā)揮作用。 小結(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的協(xié)同(CoordinationofApoptosisandProliferation,CAP)是現(xiàn)今腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。Polo-like激酶1正是參與這兩方面的重要分子。隨著對(duì)Polo-like激酶家族研究的不斷深入,Plk1在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖和凋亡方面的作用日益清晰。本實(shí)
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