AuroraB激酶在家蠶細(xì)胞周期中的調(diào)控作用研究.pdf

1、AuroraB激酶屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員，是染色體乘客復(fù)合物（CPC）的催化亞基。哺乳動(dòng)物中的研究表明，Aurora B激酶是細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中染色體濃縮與定位、姐妹染色體分離以及胞質(zhì)分裂必不可少的調(diào)控因子。Aurora B激酶在哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期進(jìn)程中的功能研究已有豐富積累，在家蠶等昆蟲(chóng)中的研究極少。我們?cè)诒狙芯恐袑?duì)家蠶Aurora B激酶（BmAurB）基因進(jìn)行了全長(zhǎng)cDNA序列克隆和表達(dá)譜分析，利用RNAi等技術(shù)分析了BmA

2、urB在家蠶細(xì)胞周期中的功能，并利用標(biāo)記定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)策略對(duì)Aurora B激酶的底物蛋白進(jìn)行了鑒定分析。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用果蠅Aurora B基因的氨基酸序列在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性檢索，發(fā)現(xiàn)家蠶預(yù)測(cè)基因BGIBMGA002350與果蠅Aurora B高度同源。以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步利用5’和3’RACE方法克隆得到家蠶Aurora B激酶（BmAurB）基因的全長(zhǎng)cDNA序列（GenBank access

3、ion number：KX420635）。BmAurB基因全長(zhǎng)為1090bp，135-1005bp區(qū)域是開(kāi)放閱讀框，共編碼289個(gè)氨基酸。將全長(zhǎng)cDNA序列與家蠶基因組序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，BmAurB基因有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。利用在線SMART程序預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)BmAurB基因的氨基酸序列含有一個(gè)保守的起磷酸化作用的S_Tkc結(jié)構(gòu)域。⑵利用雙鏈 RNA瞬時(shí)干涉及特異抑制劑處理等方法降低家蠶卵巢來(lái)源的BmN4-SID1細(xì)胞中的 BmAurB激

4、酶表達(dá)或活性，然后通過(guò)流式細(xì)胞分析來(lái)探索BmAurB激酶在細(xì)胞周期進(jìn)程中的調(diào)控作用。結(jié)果表明，針對(duì)BmAurB的雙鏈RNA瞬時(shí)干涉及特異抑制劑處理都會(huì)使細(xì)胞周期被阻斷在G2/M期，并引起DNA含量大于4N的細(xì)胞的積累。進(jìn)一步利用免疫熒光染色方法觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，在BmAurB激酶的表達(dá)或活性降低后，細(xì)胞有絲分裂前中期可發(fā)生染色體遷移異常，以至于中期出現(xiàn)染色體位置錯(cuò)亂而不能整齊排列在赤道板上；有絲分裂后期姐妹染色單體不能正常分離而形成染色

5、體橋，或發(fā)生不均等分離；胞質(zhì)分裂被阻滯，兩個(gè)子細(xì)胞不能分離而生成雙核細(xì)胞。進(jìn)一步的Western Blot實(shí)驗(yàn)表明，調(diào)控G2/M期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白CDK1以及標(biāo)記處于分裂期細(xì)胞的磷酸化組蛋白H3（pH3）的磷酸化水平隨著B(niǎo)mAurB激酶活性下降而降低。上述結(jié)果表明BmAurB激酶活性降低嚴(yán)重阻礙了家蠶的細(xì)胞周期進(jìn)程。⑶基于同位素標(biāo)記的定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)策略對(duì)Aurora B激酶新的潛在作用靶標(biāo)進(jìn)行了鑒定分析。鑒于家蠶細(xì)胞周期難于同步化，

6、我們擬用人胚腎來(lái)源的HEK293-FT細(xì)胞進(jìn)行該研究。首先利用CDK1抑制劑RO3306對(duì)HEK293-FT細(xì)胞進(jìn)行同步化處理，使大部分細(xì)胞停滯在G2期。然后更換培養(yǎng)基，一部分細(xì)胞用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)（對(duì)照組），一部分細(xì)胞用添加了Aurora B抑制劑AZD1152-HQPA的培養(yǎng)基培養(yǎng)（實(shí)驗(yàn)組），每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)；當(dāng)培養(yǎng)40 min的對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂中期時(shí)，即刻收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，并分離純化總蛋白。Western blot分析

7、顯示，AZD1152-HQPA抑制劑處理導(dǎo)致細(xì)胞中H3的磷酸化水平降低。對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的每個(gè)蛋白樣品進(jìn)行胰酶消化后，利用TiO2方法富集待測(cè)樣品中的磷酸化肽段，再通過(guò)標(biāo)記定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行鑒定分析。從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的6個(gè)樣品中，我們共鑒定到8903個(gè)磷酸肽段，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)將這些肽段匹配到3364個(gè)磷酸化蛋白。根據(jù)差異倍數(shù)≥1.2或者≤0.83以及p值＜0.05的通用參數(shù)，我們對(duì)鑒定到的磷酸化肽段進(jìn)行定量分析并發(fā)

8、現(xiàn)，16個(gè)磷酸化蛋白的25個(gè)磷酸化肽段發(fā)生上調(diào)，32個(gè)磷酸化蛋白的36個(gè)磷酸化肽段發(fā)生下調(diào)。GO分類(lèi)顯示，這些差異磷酸化蛋白均具有催化活性，主要參與信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞周期進(jìn)程等生物學(xué)過(guò)程。除了H3和H1等已經(jīng)證實(shí)為Aurora B的磷酸化底物蛋白外，我們新發(fā)現(xiàn)參與維持染色體結(jié)構(gòu)的 CBX5以及微管結(jié)合蛋白R(shí)P/EB等可能是 Aurora B的磷酸化靶蛋白。進(jìn)一步利用 RNAi方法降低BmN4-SID1細(xì)胞中的CBX5基因表達(dá)量，出現(xiàn)胞質(zhì)分裂