納豆激酶在家蠶體內的表達與活性研究.pdf

1、納豆激酶(NK)是由納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)分泌的一種具有強纖溶活性的絲氨酸蛋白酶。體內外實驗證明該酶能顯著溶解體內外血栓,明顯縮短纖維蛋白的溶解時間。并具有激活靜脈內皮細胞產生組織型纖溶酶原激活劑(t-PA),降解和失活纖溶酶原激活劑的抑制劑(pAI-1)和催化尿激酶原轉變成尿激酶等功能。動物實驗和人體志愿者實驗表明,納豆激酶經口服后可迅速入血,纖溶活性強,作用時間長,具有安全性好、口服有效等優(yōu)點。 本研究

2、將納豆激酶基因克隆到家蠶桿狀病毒表達載體系統(tǒng)轉移載體pFastBac1的EcoRI和SalI酶切位點之間,獲得重組轉移載體pFNK。將重組質粒pFNK與EcoliDH10Bac中的穿梭載體Bacmid轉座構建重組病毒BacNK。用重組病毒DNA轉染五齡家蠶幼蟲,每隔24h收集蠶血淋巴,待大部分蠶出現(xiàn)明顯病毒感染癥狀后大量收集蠶血淋巴。 將納豆激酶標準品與弗氏佐劑混合研磨制備了乳化疫苗,皮下多點免疫新西蘭大白兔,制備了抗納豆激酶抗

3、體血清。抗體血清用Protein A親和凝膠柱純化。ELISA間接法測得抗體滴度約為1:8000。 SDS-PAGE和Western blotting檢測納豆激酶在家蠶幼蟲中得到表達,表達產物分子量約30kD,和納豆激酶分子量一致。ELISA檢測結果表明：在病毒感染后120h蠶體中納豆激酶表達量較高,達40μg/ml蠶血淋巴。 納豆長期食用的安全性等特點將使納豆激酶成為新一代的理想的預防和治療栓塞的生化藥物。本實驗得到的