納豆激酶在家蠶體內(nèi)的表達(dá)與活性研究.pdf

1、納豆激酶(NK)是由納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)分泌的一種具有強(qiáng)纖溶活性的絲氨酸蛋白酶。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明該酶能顯著溶解體內(nèi)外血栓,明顯縮短纖維蛋白的溶解時(shí)間。并具有激活靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生組織型纖溶酶原激活劑(t-PA),降解和失活纖溶酶原激活劑的抑制劑(pAI-1)和催化尿激酶原轉(zhuǎn)變成尿激酶等功能。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體志愿者實(shí)驗(yàn)表明,納豆激酶經(jīng)口服后可迅速入血,纖溶活性強(qiáng),作用時(shí)間長,具有安全性好、口服有效等優(yōu)點(diǎn)。 本研究

2、將納豆激酶基因克隆到家蠶桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)移載體pFastBac1的EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)之間,獲得重組轉(zhuǎn)移載體pFNK。將重組質(zhì)粒pFNK與EcoliDH10Bac中的穿梭載體Bacmid轉(zhuǎn)座構(gòu)建重組病毒BacNK。用重組病毒DNA轉(zhuǎn)染五齡家蠶幼蟲,每隔24h收集蠶血淋巴,待大部分蠶出現(xiàn)明顯病毒感染癥狀后大量收集蠶血淋巴。 將納豆激酶標(biāo)準(zhǔn)品與弗氏佐劑混合研磨制備了乳化疫苗,皮下多點(diǎn)免疫新西蘭大白兔,制備了抗納豆激酶抗

3、體血清?？贵w血清用Protein A親和凝膠柱純化。ELISA間接法測得抗體滴度約為1:8000。 SDS-PAGE和Western blotting檢測納豆激酶在家蠶幼蟲中得到表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物分子量約30kD,和納豆激酶分子量一致。ELISA檢測結(jié)果表明：在病毒感染后120h蠶體中納豆激酶表達(dá)量較高,達(dá)40μg/ml蠶血淋巴。 納豆長期食用的安全性等特點(diǎn)將使納豆激酶成為新一代的理想的預(yù)防和治療栓塞的生化藥物。本實(shí)驗(yàn)得到的