產(chǎn)納豆激酶菌株的分離篩選與鑒定.pdf

1、血栓性疾病嚴(yán)重危害人類的健康和生命，對(duì)個(gè)人、家庭和社會(huì)都造成了巨大的物質(zhì)和精神損失。但目前臨床治療血栓性疾病最常用的溶栓劑卻不盡如人意：或特異性差有嚴(yán)重副作用；或作用時(shí)間短、溶栓能力弱，需長(zhǎng)時(shí)間、大劑量使用；或者生產(chǎn)不易，物稀價(jià)昂。 納豆(natto)在日本是一種歷史悠久的傳統(tǒng)食品，系由蒸煮后的大豆接種納豆芽孢桿菌發(fā)酵制得。納豆芽孢桿菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的納豆激酶(Nattokinase，NK)是一種具有強(qiáng)烈纖溶活性的堿性絲氨酸蛋

2、白酶。與傳統(tǒng)溶栓劑相比納豆激酶具有纖溶作用強(qiáng)，藥效時(shí)間長(zhǎng)，可通過(guò)靜脈與口服兩種途徑給藥以及不引起出血的副作用等優(yōu)點(diǎn)，使其具有開發(fā)成新一代溶栓藥以及新型保健產(chǎn)品的潛力。 本研究從五株出發(fā)菌株中分離篩選出納豆芽孢桿菌并進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)物的纖溶活性測(cè)定納豆激酶的酶活，篩選出一株產(chǎn)酶活力較高，酶活穩(wěn)定的菌株N391。主要結(jié)論如下： 1.對(duì)能產(chǎn)生納豆激酶的菌群進(jìn)行了篩選，經(jīng)纖維蛋白平板復(fù)篩多次，分離得到了24株高纖溶活性有

3、效菌株，經(jīng)鑒定均為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其納豆激酶相當(dāng)于尿激酶的酶活均大于1000U/mL2經(jīng)過(guò)遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以及納豆固體發(fā)酵感官評(píng)價(jià)最終得到菌株N391，其納豆激酶相當(dāng)于1722.4U/mL尿激酶酶活。 2.對(duì)分離得到的菌株N391進(jìn)行常規(guī)的形態(tài)、生理生化特征以及與枯草芽孢桿菌的比較，初步判斷該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 3.利用細(xì)菌16S rDNA通用引物對(duì)其16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得

4、到1511bp的片段，該P(yáng)CR產(chǎn)物序列通過(guò)Blast軟件在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行同源性比較，通過(guò)DNA MAN和MAGE3.1軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明：菌株N391的16S rRNA序列(DQ906100)與枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)的16S rRNA序列的同源性在99％以上，在系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株N391與Bacillus subtilis在同一分支，且遺傳距離最短。結(jié)合常規(guī)的形態(tài)、生理生化鑒定，N39l的形態(tài)及