前納豆激酶原基因的克隆與表達(dá).pdf

1、納豆激酶(nattokinase簡(jiǎn)稱NK)是一種枯草芽孢桿菌蛋白激酶，是在納豆發(fā)酵過(guò)程中由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，該酶具有強(qiáng)烈溶栓活性。本研究的目的是克隆前納豆激酶原基因，實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌中的表達(dá)，并對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行研究。方法是從枯草芽胞桿菌中分離純化基因組DNA作為模板，通過(guò)PcR擴(kuò)增前納豆激酶原基因，將其克隆到質(zhì)粒pUCl9中，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pNK并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，序列分析結(jié)果表明，所克隆片段全長(zhǎng)1152bp，

2、與Gerlebank中已報(bào)道序列相比較，同源性達(dá)到100[％]。將目的基因片段分別與表達(dá)載體pBV220和pET30a連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBNK和pENK，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌HBlol和BL21(DE3)，用溫度誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化菌pBNK6-HBI01，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳觀察到了特異條帶，不同誘導(dǎo)溫度、時(shí)間及培養(yǎng)基比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化菌pBNK6-HBl01在BL培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)，42℃誘導(dǎo)7小時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，約占菌體總蛋白