納豆激酶在禽輸卵管表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)特性研究.pdf

1、納豆激酶(Natto kinase，NK)是一種由納豆菌或納豆枯草桿菌產(chǎn)生的堿性絲氨酸蛋白酶，具有安全性好、成本低、纖溶活性強(qiáng)、可口服、作用時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為研究血栓藥物的新熱點(diǎn)，有望被開發(fā)為新一代用于血栓性疾病的預(yù)防和治療的口服抗血栓藥物。本研究旨在構(gòu)建納豆激酶在禽輸卵管特異性表達(dá)的慢病毒載體，采用雞輸卵管上皮細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞中進(jìn)行外源基因特異表達(dá)研究。主要研究結(jié)果如下:
　　從雞血中提取總基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到

2、2.8kb的雞卵清蛋白啟動(dòng)子(OV2)和666bp的雌激素反應(yīng)元件(ERE)。將其連接在慢病毒表達(dá)載體pLV-eGFP上，并替換pLV-eGFP上原有的CMV啟動(dòng)子，經(jīng)菌液PCR、酶切和測(cè)序鑒定獲得了重組質(zhì)粒pLV-OV2-ERE-eGFP。將大小為2077bp，經(jīng)化學(xué)合成含納豆激酶基因的NK-2A-eGFP基因片段插入質(zhì)粒上pLV-OV2-ERE-eGFP，替換pLV-OV2-ERE-eGFP上原有的eGFP片段，經(jīng)菌液PCR、酶切和

3、測(cè)序鑒定獲得了重組納豆激酶慢病毒表達(dá)載體pLV-OV2-ERE-NK-2A-eGFP。
　　將納豆激酶慢病毒表達(dá)載體pLV-OV2-ERE-NK-2A-eGFP經(jīng)慢病毒包裝后，分別轉(zhuǎn)染雞輸卵管上皮細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的輸卵管上皮細(xì)胞48h后出現(xiàn)綠色熒光細(xì)胞，雞輸卵管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率約為10％，而成纖維細(xì)胞沒(méi)有發(fā)現(xiàn)綠色熒光，表明卵清蛋白啟動(dòng)子在雞輸卵管上皮細(xì)胞具有一定表達(dá)特異性。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量