人血清白蛋白鵪鶉輸卵管特異表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá).pdf

1、人血清白蛋白(humanserumalbumin，HAS)是人血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)起著維持血液滲透壓、運輸、營養(yǎng)等作用。因而在國內(nèi)外都有很大的市場需求。禽類輸卵管生物反應(yīng)器是基因制藥的新方法，其生產(chǎn)藥用蛋白具有安全、高效、成本低廉等優(yōu)點，因此，通過制備禽類輸卵管生物反應(yīng)器生產(chǎn)人血清白蛋白將具有美好的前景。 禽類生物反應(yīng)器的研究，主要在于能構(gòu)建在禽類體內(nèi)能有效調(diào)控外源基因表達(dá)的特異表達(dá)載體。其中上游載體的構(gòu)建首要條件，實

2、現(xiàn)外源基因在鵪鶉輸卵管組織中的特異性表達(dá)必須有組織特性型的啟動子的參與。本試驗以鵪鶉卵清蛋白5’調(diào)控區(qū)為調(diào)控序列，來啟動人血清白蛋白HAS的表達(dá)，構(gòu)建了含有新霉素抗性基因、綠色熒光蛋白報告基因的人血清白蛋白輸卵管特異性表達(dá)載體，為下一步通過體細(xì)胞核移植法制備輸卵管生物反應(yīng)器生產(chǎn)人血清白蛋白打下堅實的基礎(chǔ)。本實驗主要從以下幾個方面進(jìn)行了研究，其結(jié)果如下： 1.人血清白蛋白基因的克隆 RT-PCR技術(shù)成功地擴(kuò)增，克隆了含人

3、血清白蛋白序列長約1.8kb的片段，經(jīng)電泳初步鑒定為目的基因后，產(chǎn)物純化后連至pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。.篩選陽性克隆菌，酶切鑒定并進(jìn)行序列分析酶切鑒定并進(jìn)行測序，結(jié)果與GeneBank中登錄的人的血清白蛋白cDNA序列的同源性為97％，有個別堿基發(fā)生突變，突變并沒有引起最大讀碼框的改變，即成功的克隆了HSA的cDNA序列。 2人血清白蛋白鵪鶉輸卵管特異表達(dá)載體的構(gòu)建 (1)以鵪鶉卵清蛋白5’調(diào)控區(qū)POV來

4、啟動HAS的表達(dá)。重新設(shè)計HSAcDNA引物，分別在上下游引物5’端添加含有限制性內(nèi)切酶kpnⅠ和HindⅢ酶切位點，重新擴(kuò)增了HAScDNA序列。用限制性內(nèi)切酶klanⅠ和HindⅢ雙酶切質(zhì)粒pOV和pHSA，然后用T4連接酶定向連接成重組質(zhì)粒pOV-pHSA，經(jīng)酶切鑒定，兩者成功融合。 (2)采用雙酶切定向克隆的方法，利用真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP構(gòu)建了含有抗性基因、報告基因的人血清白蛋白非融合型輸卵管表達(dá)載體pEG

5、FP-VH。用PCR方法和酶切方法檢測，表明其中的整個人血清白蛋白輸卵管表達(dá)構(gòu)件插入位點準(zhǔn)確無誤。 3人血清白蛋白基因在鵪鶉輸卵管上皮細(xì)胞和鵪鶉成纖維細(xì)胞表達(dá) (1)培養(yǎng)了鵪鶉自身的兩種細(xì)胞：鵪鶉輸卵管上皮細(xì)胞和鵪鶉胚胎成纖維細(xì)胞作為檢測平臺，將重組后的人血清白蛋白表達(dá)載體用脂質(zhì)體包埋法轉(zhuǎn)染以上兩種細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察到報告基因綠色熒光蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明構(gòu)建的表達(dá)載體在成纖維細(xì)胞上未見表達(dá)；而鵪鶉原代輸卵管上皮細(xì)胞