人血清白蛋白-人白介素-2融合蛋白的表達(dá)與發(fā)酵.pdf

1、白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是分子量為15kDa的糖蛋白，在體內(nèi)由T細(xì)胞產(chǎn)生，通過促進(jìn)T細(xì)胞的增值，增強(qiáng)人體的免疫能力。為提高IL-2在體內(nèi)的半衰期，實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了攜帶有IL2-HSA融合蛋白編碼基因的質(zhì)粒pPIH，并在PichiapastorisKM71中表達(dá)。本研究在此基礎(chǔ)上，通過三種溶氧控制策略和甲醇誘導(dǎo)條件的改變，試圖在5L罐中，探索提高產(chǎn)物表達(dá)量的最優(yōu)條件，結(jié)果證明已構(gòu)建的P.pastorisKM71/

2、pPIH，產(chǎn)物的最大表達(dá)量為44mg/L，該菌株生產(chǎn)潛力小。 構(gòu)建了3株不同宿主的IL2-HSA表達(dá)菌，P.pastorisGS115/pPIH、P.pastorisKM71/pPIH、P.pastorisSMD1168/pPIH。對(duì)其誘導(dǎo)條件優(yōu)化后，在各自的最優(yōu)表達(dá)條件下進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，GS115最適合表達(dá)IL2-HSA融合蛋白，其搖瓶表達(dá)量為314mg/L，分別是KM71，SMD1168表達(dá)量的2.7倍和2.9倍。對(duì)三株菌的發(fā)

3、酵上清進(jìn)行WesternBlot驗(yàn)證，結(jié)果顯示，81kDa處的條帶可以與HSA和IL2兩種抗體都發(fā)生免疫反應(yīng)，且分子量與理論計(jì)算相符，認(rèn)為是完整的IL2-HSA蛋白。發(fā)酵清液經(jīng)脫鹽、凍干保存，取干粉復(fù)溶后，用CTLL-2/MTT法測得粗蛋白的IL-2生物學(xué)活性為1.05×106IU/mg。 最后根據(jù)密碼子的偏愛性以及IL-2的結(jié)構(gòu)特性，本研究對(duì)天然IL2編碼序列進(jìn)行了優(yōu)化，用高頻密碼子替換其中低頻密碼子，并將第125位游離Cys