間接elisa法測定抗人血清白蛋白效價

1、1間接間接ELISAELISA法測定抗人血清白蛋白效價法測定抗人血清白蛋白效價作者：ZP（成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院09級醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科二班，610500）【摘要摘要】目的目的通過運(yùn)用間接ELISA法，來測定抗人血清白蛋白的效價。方法方法用抗原、酪蛋白分別包被、封閉微孔板，再加入待檢血清、一抗、二抗，建立間接包被模式酶聯(lián)免疫法。經(jīng)方陣滴定確定抗原和酶標(biāo)抗體的最適濃度后，測定抗體效價。結(jié)果結(jié)果在包被的人ALB濃度為0.1ugml，二抗1：2000

2、0的稀釋倍數(shù)時，測出的抗人ALB的效價范圍為1：51200。結(jié)論結(jié)論運(yùn)用間接ELISA法，在檢測抗人ALB的靈敏度高，優(yōu)化了反應(yīng)條件，可用于初步抗人ALB的檢測。【關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞】間接ELISA；抗人血清白蛋白；效價；羊抗人ALB、兔抗羊IgGHRP間接ELISA法，是目前最常用的方法，因其靈敏度高，操作簡便而被運(yùn)用廣泛。此方法是測定抗體最常用的方法，屬于非競爭結(jié)合試驗(yàn)。其原理是將抗原連接到固相載體上，樣品中待測抗體與之結(jié)合成固相抗原受檢

3、抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)二抗與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原受檢抗體酶標(biāo)二抗復(fù)合物，測定加底物后的顯色程度，確定待測抗體含量。此次試驗(yàn)就是用間接ELISA測定未知的抗人ALB的效價。1、主要試劑、儀器、材料及主要溶液的配制、主要試劑、儀器、材料及主要溶液的配制1.1主要試劑主要試劑：人ALB標(biāo)準(zhǔn)品（250mg支）；一抗(羊抗人ALB，效價1:701ml瓶，批號：201106貯存于4～20℃，有效期：2年)；二抗(兔抗羊IgGHRP

4、，購自武漢博士德生物工程有限公司)；顯色劑：A液、B液，ME002可溶性TMB顯色液；終止液（2MH2SO4）；包被液：0.05MPH9.6碳酸鹽緩沖液；洗滌液0.05%TWEENPBS；PBS緩沖液0.1MPH7.4；封閉液1%酪蛋白PBST.1.21.2儀器：儀器：洗板機(jī)（BIORADMODEL1575）、孵箱（上海恒科學(xué)儀器有限公司型號：DHP9272）、SM3自動化酶免疫分析儀（北京天石醫(yī)療用品制作所）1.31.3材料：材料：9

5、6孔酶標(biāo)板、一次性塑料試管、加樣槍（上海求精生化試劑儀器有限公司）1.4主要溶液的配制：主要溶液的配制：1)、0.05MolLPH96的碳酸鹽緩沖液（包被稀釋液）：準(zhǔn)確稱取1.6g碳酸鈉，2.9g碳酸氫鈉于燒杯中加水適量使溶解，用去離子水定溶于1L的容量瓶中，同時調(diào)節(jié)PH值至9.6；2)、PH7.4PBS緩沖液:準(zhǔn)確稱取氯化鈉8g，氯化鉀0.2g，十二水和磷酸氫二鈉3.58g，磷酸二氫鉀0.2g于燒杯中，用去離子水定溶于1L的容量瓶中，

6、同時調(diào)節(jié)PH值至7.4；3)、封閉液1%酪蛋白PBST：準(zhǔn)確稱取3g酪蛋白于以潔凈燒杯中，再加入300mlPBS溶液和150ulTween20。將燒杯置于電爐上邊攪拌邊加熱，直至酪蛋白完全溶解；4)、洗滌液0.05%TWEENPBS：向1000mlPH7.4PBS緩沖液中加入500μlTween20。PBST既是洗板液也是溶解封閉劑酪蛋白（1%）的溶解試劑，配方為PBSTween20.2、方法、方法2.1微孔板制備微孔板制備：將96孔板

7、劃分為四個區(qū)域，每個區(qū)域4行6列。在1至4區(qū)的每微孔中分別加入100ul濃度為10μgml、1μgml31：10000，1：20000加入，（如表2所示），其他步驟同上2.1～2.3所述。表23、結(jié)果、結(jié)果3.13.1酶標(biāo)抗體工作濃度的結(jié)果酶標(biāo)抗體工作濃度的結(jié)果預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測人ALB的最適濃度和兔抗羊HRP最適比例，測得的光密度（OD值）：表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：本次預(yù)實(shí)驗(yàn)中，4種不同包被抗原濃度組的結(jié)果均出現(xiàn)了不同程度跳躍，未出現(xiàn)正確的梯度變化

8、，且背景太高，背景過高導(dǎo)致所有組均無法進(jìn)行線性分析，所以預(yù)實(shí)驗(yàn)失敗。根據(jù)全班8個96孔板中篩選出包被抗原在0.01μgml和0.1μgml，二抗?jié)舛仍?：10000和1:20000的條件下，得出稍微有梯度的數(shù)據(jù)。3.23.2待測血清效價的確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果待測血清效價的確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果一抗一抗二抗二抗1:1001:1001:2001:2001:4001:4001：8008001:16001:16001:32001:32001:64001:6400

9、1:128001:128001:256001:256001:512001:512001:1024001:102400PBSPBS1:100001:100001:200001:200001:100001:100001:200001:200001234567891011121.9632.2532.0002.1382.1951.8231.6091.8441.7911.9921.8671.3801.9251.7351.8512.0412.091

10、1.7961.8351.9131.8431.6571.6441.5681.6191.8211.5961.3281.3771.1201.6931.5211.7441.0931.5150.9090.7860.6140.6100.5130.4270.0690.8201.0100.4300.3130.2540.6121.7651.5221.6581.7501.8711.7291.4261.6961.6402.0640.1381.5141.676