間接elisa檢測抗血清效價

1、間接間接ELISAELISA檢測抗血清效價檢測抗血清效價姓名：王賢臣學號：1125400080（成都醫(yī)學院醫(yī)學檢驗成都610500）【摘要摘要】目的目的：通過實驗掌握間接酶聯(lián)免疫吸附測定技術（ELISA）的原理及操作過程及間接ELISA檢測抗血清效價的實驗條件優(yōu)化及效價的確定。方法方法：間接ELISA雙抗體夾心法對包被抗原及酶標抗體工作濃度進行探索。結果結果：經(jīng)過預實驗初步確定抗人白蛋白血清包被濃度和一二抗的濃度，然后在正式實驗確定其濃

2、度，從而再進行研究。討論討論：間接ELISA檢測抗血清效價的影響因素。并將預實驗方法的結果與確定實驗的結果進行對比，和分析在實驗過程中的注意事項。【關鍵詞關鍵詞】抗人白蛋白ABLELISA前言前言：1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附測定用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術發(fā)展為體液標本中微量物質的測定方法。之一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持器免疫

3、活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原后抗體即保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)顏色反應的深淺定性或

4、定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大的放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。實驗方法：實驗方法：預實驗設計方案：預實驗設計方案：1、材料與方法1.1儀器：洗板機（BIORADMODEL1575）SM自動化酶免疫分析儀（北京天石醫(yī)療用品制作所BIORAD680）電熱恒溫箱（上海恒科技儀器有限公司）移液槍（上海求精生化試劑儀器有限公司）微孔反應板刻度吸管（5ml、1ml）吸耳球試管架塑料試管封口紙燒杯1.2試劑：人ALB標準品（

5、SIGMA:A1653SIZE:250MGstage:28℃）PBS緩沖液：0.1MpH7.4(PBS1L配方pH7.4：磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.2g，十二水水磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2O)3.58g，氯化鈉(NaCl)8.0g，氯化鉀(KCl)0.2g，加水至1000mL)包被液：0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液洗滌液：0.05%TweenPBS(即PBST)(0.05%TweenPBS1000mlPBS加500ul吐

6、溫）0.01ugml0.1ugml1ugml10ugml（2）酶標結合物（兔抗羊IgGHRP）稀釋為：1:5001:20001:80001:16000（3）抗人白蛋白血清（羊抗人ALB血清）稀釋為：1:101:401:1601:6401:2560在初步結果的基礎上繼續(xù)細化工作濃度，重新檢測以確定最終最適包被抗原和酶標抗體的最終工作濃度，即建立間接ELISA法檢測抗人白蛋白血效價。②正式包被抗原(100ul孔)↓4℃過夜或37℃2h洗滌3

7、次拍干加封閉液(300ul孔)↓4℃過夜或37℃2h洗滌3次拍干加入標本(100ul孔)↓37℃1h洗滌5次拍干加入酶標抗體(100ul孔)拍干↓37℃1h洗滌5次加入顯色劑A、B液各50ul孔↓37℃1520min加入終止液(100ul孔)↓檢測表2：包被抗體和酶標記抗體棋盤滴定包被抗原的濃度為0.1ugml0.01ugml，每個濃度做三排，共做六排，測出OD值羊抗人ALB血清兔抗羊IgGHRP1:101:401:1601:6401: