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文檔簡介
1、雞毒霉形體(Mycoplasma gallisepticum,MG)是雞慢性呼吸道病(Chronic respiratory disease,CRD)和火雞傳染性竇炎(Infectious sinusitis)的主要病原菌。該病的實驗室診斷方法主要有病原的分離鑒定、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法等,病原的分離鑒定是診斷MG感染最可靠的方法,但病原分離存在操作復(fù)雜、工作量大、時間長等缺點。免疫學(xué)方法有血清平板凝集試驗(SPA)、血凝抑制試驗(
2、HI)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、熒光抗體技術(shù)等。這些方法雖然簡便易行,但大多只是對抗體做出檢測,不能用于MG早期感染和隱性感染的檢測,且存在非特異性反應(yīng)和交叉反應(yīng)性,所以并不能對MG感染做出快速準(zhǔn)確的診斷。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、核酸探針等分子生物學(xué)方法可檢測抗原,但這些方法對試驗設(shè)備和人員素質(zhì)有很高的要求,目前還難以廣泛推廣和應(yīng)用。
本研究制備了鼠抗MG單克隆抗體和兔抗MG多克隆抗體,建立了針對MG抗原的間接夾
3、心ELISA檢測技術(shù),為雞毒霉形體病的快速診斷提供了一種新的檢測方法,取得了如下結(jié)果。
1.兔抗MG多克隆抗體的制備
將經(jīng)純化的MG-HS菌液接種于FM-4固體平板上,37℃培養(yǎng)7~10d,取出后在40×顯微鏡下觀察其菌落形態(tài),呈典型的荷包蛋狀菌落,將MG-HS菌液擴大培養(yǎng)并離心,洗滌沉淀4次,制成100倍濃縮菌懸液,測定蛋白濃度為18mg/ml,所得懸液與弗氏佐劑乳化后免疫家兔,得到兔抗MG的高免血清,其瓊
4、擴效價達到1:32,經(jīng)飽和硫酸銨粗提、G-200過柱純化后,經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定其純度,呈典型的IgG條帶,為MG抗原檢測間接夾心ELISA診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
2.MG單克隆抗體的制備與純化
將制成的100倍濃縮菌懸液調(diào)節(jié)濃度至2mg/ml,與弗氏佐劑乳化后免疫BALB/c小鼠,待小鼠血清的ELISA抗體效價達1:10000以上時,將小鼠脫頸椎處死制備免疫脾細胞,與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合,
5、經(jīng)過2輪細胞融合、多次篩選和克隆,最后獲得2株針對MG的且能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞(287和6G9)。染色體數(shù)目分別為86.6和86.9;經(jīng)小鼠腹腔接種后收獲腹水,287細胞株的間接ELISA效價為1:5.12×105,6G9株的間接ELISA效價為1:2.56×105,且均不與其它禽類呼吸道病原發(fā)生交叉反應(yīng);用間接ELISA方法對2株單抗的相對親和力進行鑒定,結(jié)果表明287的親和力高于6G9。說明這2株單抗特異性強,靈敏度高,
6、可用于MG抗原的ELISA檢測。
3.檢測MG抗原的間接夾心EIASA方法的建立
以純化的兔抗MG IgG為第一抗體包被酶標(biāo)板,鼠抗MG單克隆抗體為第二抗體,結(jié)合羊抗鼠IgG-HRP,通過對ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化選擇,建立了檢測MG抗原的間接夾心ELISA法。方陣滴定的結(jié)果表明,兔抗MG IgG的最佳工作濃度為1μg/mL,鼠抗MG單克隆抗體的最佳工作濃度為5μg/mL;用所建立的間接夾心ELISA方法對3
7、0份健康雞氣管拭子材料進行了檢測,將陰性樣品取平均OD450值,再加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差即OD450+3S(0.054+3×0.023=0.123)定為陰、陽結(jié)果判定臨界值。但考慮到臨界值與陰性值太接近,故最終將陰、陽性結(jié)果的臨界值定為0.2;對已知的不同濃度梯度的MG培養(yǎng)液進行檢測,結(jié)果表明該方法所能夠檢測的MG抗原的濃度下限為5×101cfu/ml,即待檢樣本中含有50個菌體既能被檢測為陽性;板內(nèi)變異系數(shù)為0.41%~6.72%;板間變異系
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