牛羊肉骨粉夾心ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、牛海綿狀腦病(BSE)被國際獸疫局(OIE)列為B類動(dòng)物傳染病，在我國被列為一類動(dòng)物疫病。它給全世界特別是發(fā)達(dá)國家的養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大災(zāi)難，而且在食用了被BSE病原污染了的牛肉產(chǎn)品后，會(huì)引起人的新變異克雅氏癥，嚴(yán)重威脅著人類健康，因此世界各國都在采取各種積極措施防止瘋牛病的傳播。英國的流行病學(xué)研究證實(shí)，污染的飼料是BSE傳播的主要途徑。因此為防止BSE的傳播，國際動(dòng)物衛(wèi)生法典中明確規(guī)定，禁止在反芻動(dòng)物的飼料中添加反芻動(dòng)物肉骨粉。為保證這一

2、措施的有效實(shí)施，必須加強(qiáng)對(duì)飼料中肉骨粉的檢測(cè)。本研究在克隆表達(dá)牛肌鈣蛋白Ⅰ的基礎(chǔ)上，研制了針對(duì)肌鈣蛋白Ⅰ的牛羊特異性的單抗，并進(jìn)一步建立了肉骨粉檢測(cè)的夾心ELISA方法。 骨骼肌中的肌鈣蛋白Ⅰ(sTnI)是一種耐熱性蛋白，并且在骨骼肌中的含量比較大(5mg/g)，鹽溶性，在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中不易丟失，因此sTnI是檢測(cè)飼料中肉骨粉的一種比較理想的標(biāo)志物。sTnI有快肌型和慢肌型兩個(gè)亞型，牛的這兩個(gè)亞型的核苷酸序列目前在GenBan

3、k中還沒有被收錄，但已被收錄的哺乳動(dòng)物的核苷酸序列的比對(duì)結(jié)果表明，這兩個(gè)亞型的核苷酸序列在哺乳動(dòng)物之間均具有很高的同源性(90％左右)，因此根據(jù)GenBank中其他哺乳動(dòng)物的核苷酸序列分別設(shè)計(jì)引物克隆了牛的快肌型肌鈣蛋白Ⅰ和慢肌型肌鈣蛋白Ⅰ。序列比對(duì)結(jié)果表明，克隆的這兩個(gè)片段的核苷酸序列與GenBank中的其他哺乳動(dòng)物的核苷酸序列均具有90％左右的同源性，這說明了克隆的這兩個(gè)片段是牛的快肌型肌鈣蛋白Ⅰ和慢肌型肌鈣蛋白Ⅰ；隨后將這兩個(gè)片段

4、插入到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)。免疫印跡試驗(yàn)表明，這兩個(gè)原核表達(dá)產(chǎn)物的小鼠血清，均可以識(shí)別從牛骨骼肌中提取的肌鈣蛋白Ⅰ，這證明了兩個(gè)原核表達(dá)產(chǎn)物確實(shí)是牛的快肌型肌鈣蛋白Ⅰ和慢肌型肌鈣蛋白Ⅰ，也進(jìn)一步證明了克隆的這兩個(gè)片段確實(shí)是牛的快肌型肌鈣蛋白Ⅰ和慢肌型肌鈣蛋白Ⅰ的基因片段。 氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，牛的快肌型肌鈣蛋白Ⅰ的氨基酸序列與GenBank中其他哺乳動(dòng)物的快肌

5、型肌鈣蛋白Ⅰ氨基酸序列具有93％以上的同源性；牛的慢肌型肌鈣蛋白Ⅰ的氨基酸序列與GenBank中其他哺乳動(dòng)物的慢肌型肌鈣蛋白Ⅰ的氨基酸序列具有95％以上的同源性，因此快肌型肌鈣蛋白Ⅰ要比慢肌型肌鈣蛋白Ⅰ更適合作為免疫抗原來進(jìn)行單克隆抗體的研制。用牛的快肌型肌鈣蛋白Ⅰ的原核表達(dá)產(chǎn)物免疫6周齡的BALB/c雌性小鼠，每只每次皮下注射100μg，每隔兩周免疫一次，免疫3次后，取小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞sp2/0-Ag-14進(jìn)行融合，以牛骨骼肌和

6、豬骨骼肌的粗提物作為篩選抗原，通過間接ELISA方法對(duì)雜交瘤進(jìn)行篩選，經(jīng)亞克隆篩選到4株(1G11、3C4、8D5、13D10)牛羊特異性的單克隆抗體和4株(6G12、9D8、T4、T8)哺乳動(dòng)物特異性的單克隆抗體。經(jīng)過對(duì)這8株單克隆抗體的特異性、親和力和抗原表位的比較，選取了特異性比較好的單克隆抗體1G11和親和力比較高的單克隆抗體T8分別作為檢測(cè)抗體和捕捉抗體，建立了夾心ELISA方法用于飼料中牛羊肉骨粉的檢測(cè)；并且對(duì)該方法的捕捉抗