檢測(cè)鴨沙門氏菌抗原的間接夾心ELISA方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、鴨沙門氏菌病通常為禽副傷寒，是由一種或幾種沙門氏菌引起的鴨的常見多發(fā)性傳染病，嚴(yán)重影響雛鴨的存活率，尤其是與大腸桿菌或鴨疫里氏桿菌混合感染時(shí)，其發(fā)病率和死亡率都會(huì)更高，給養(yǎng)鴨行業(yè)造成很大損失;成鴨多為慢性或者隱形感染，多不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀卻導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降。沙門氏菌屬于人畜共患病，對(duì)其進(jìn)行研究具有重要的意義。
　　本課題以實(shí)驗(yàn)室分離保存的鴨沙門氏菌為材料，通過制備鴨沙門氏菌抗原、鴨抗沙門氏菌IgG、兔抗沙門氏菌IgG來展開用間接

2、夾心ELISA方法對(duì)鴨沙門氏菌抗原檢測(cè)的研究，以及對(duì)建立的檢測(cè)鴨沙門氏菌抗原的ELISA方法的應(yīng)用來做報(bào)道。研究結(jié)果如下:
　　1.制備了鴨沙門氏菌抗原，稀釋法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，測(cè)得鴨沙門氏菌的濃度為5×1011 CFU/ml，大于1010 CFU/ml，符合要求。
　　2.用辛酸-硫酸銨方法分別從鴨抗沙門氏菌高免血清、兔抗沙門氏菌高免血清中提取了IgG，經(jīng)透析后，用核酸蛋白儀測(cè)定鴨抗沙門氏菌IgG的濃度為5.0146g/L;兔

3、抗沙門氏菌IgG的濃度為22.785g/L。
　　3.以鴨沙門氏菌IgG為第一抗體包被酶標(biāo)板，兔抗沙門氏菌IgG為第二抗體，結(jié)合酶標(biāo)抗體羊抗兔IgG-HRP，通過對(duì)ELISA反應(yīng)條件的篩選，成功建立了檢測(cè)鴨沙門氏菌抗原的間接夾心ELISA方法。方陣滴定表明:鴨抗沙門氏菌IgG最佳包被濃度為12.5μg/ml，兔抗沙門氏菌IgG最佳工作濃度為22μg/ml。鴨抗沙門氏菌IgG包被時(shí)間及溫度為37℃2h后4℃過夜;最適封閉液為0.5％

4、明膠，封閉時(shí)間為90 min;鴨沙門氏菌抗原孵育時(shí)間為60 min;兔抗沙門氏菌IgG孵育時(shí)間為90 min;酶標(biāo)羊抗兔IgG稀釋度為1∶5000，最佳孵育時(shí)間60 min;最優(yōu)底物反應(yīng)時(shí)間為25 min。
　　4.用建立的方法測(cè)定10份鴨沙門氏菌陰性樣品，算出陰、陽性臨界值為0.362。重復(fù)性試驗(yàn)3份陰、陽性樣品變異系數(shù)分別為3.8％、0.3％、3.7％，0.3％、1.4％、0.5％，均小于規(guī)定的板內(nèi)變異系數(shù)10％。此方法的最低

5、檢測(cè)鴨沙門氏菌量為104 CFU/ml。保存期試驗(yàn)表明，包被并封閉洗滌后的酶標(biāo)板可以在4℃條件下保存8周。用所建立的方法檢測(cè)大腸桿菌、鴨疫里氏桿菌、鴨肝炎病毒均為陰性，不與沙門氏菌發(fā)生交叉反應(yīng)。故所建立的方法在重復(fù)性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)、靈敏性試驗(yàn)以及保存期試驗(yàn)具有重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高、保存期較長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。
　　5.用間接夾心ELISA方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組病死鴨各組織器官中鴨沙門氏菌，以肺、肝的檢出率最高分別為100％、90％，其次心