雞毒霉形體HS株TM-1和mgc3基因的表位預測及原核表達.pdf

1、雞毒霉形體(Mycoplasma gallisepticum，MG)是雞慢性呼吸道疾病的病原菌，世界各地均有MG的感染和流行，雖然不直接引起禽的大規(guī)模死亡，但疾病的慢性、遷延性流行過程可引起產(chǎn)蛋率下降、孵化率降低、出欄期延長及飼料利用率降低，每年給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。 目前MG的診斷方法主要有病原的分離鑒定、血清平板凝集試驗、PCR和ELISA等方法，但上述方法由于耗時或操作復雜或需要昂貴儀器等缺點，難以在基層推廣應

2、用，因此MG新型的快速診斷也成為該病急需解決的問題之一。膠體金免疫層析快速檢測MG的方法簡便、快速、直觀，但是研制抗不同抗原表位的單克隆抗體是該方法建立的重要前提。本研究對MG菌體保護性蛋白TM-1和mgc3基因的表達及抗原表位進行了探討，旨在為ELISA方法、膠體金免疫層析法快速檢測方法及基因工程抗原疫苗的研制提供理論依據(jù)，主要展開了以下研究。 1.雞毒霉形體保護性抗原基因TM-1和mgc3的克隆 參照NCBI收錄的T

3、M-1和mgc3基因序列設計引物，以MG基因組為模板，擴增出TM-1和mgc3，經(jīng)測序，所獲得的TM-1基因為819bp；mgc3基因為3186bp。 2.TM-1和mgc3基因序列的分析及抗原表位的預測 TM-1基因測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫中BIAST比對，與S6株同源性為99％，其中103-134bp和135-166bp為重復序列，抗原表位及二級結構的預測參數(shù)綜合分析，該重復區(qū)具有強抗原表位活性；與R株有兩個同源性序

4、列，同源性分別為91％和93％。對mgc3基因的全基因序列BLAST比對，得到三條同源性達99％的序列，此外還有三條序列只與mgc3基因的1-1300bp具有同源性，分別是99％、98％和91％。選取了HS株的mgc3基因1000-3186bp的區(qū)域進行抗原表位軟件預測，得到1142-1440bp、1704-2169bp、2165-2521bp和2507-2835bp區(qū)域具有較強的抗原活性。它們不僅親水性、表面可及性、抗原性參數(shù)較高，而

5、且每段序列的上下游引物都包含了該區(qū)的所有突變位點；MG-HS株的mgc3基因中還有10個編碼色氨酸TGA的位點。 3．雞毒霉形體TM-1和mgc3基因抗原表位區(qū)的原核表達及其活性鑒定 將經(jīng)過分析的含有高免疫活性的目的片段亞克隆到表達載體pGEX-KG，經(jīng)轉化、誘導后獲得表達蛋白，SDS-PAGE分析表明融合表達的蛋白分子量分別約為55KDa、37 KDa和44 KDa。Western blot印跡證明表達蛋白均具有免疫學