雞防御素基因的克隆、組織分布及Gal-2基因的原核表達.pdf

1、為了對雞基因組中防御素基因的序列和表達情況進行研究。本實驗選取不同日齡的來航雞為研究對象，應用分子克隆技術，分別設計了13對特異性引物對雞體內(nèi)的13種防御素基因片斷進行克隆和序列分析，成功克隆了Gal-1～Gal-12基因，并研究了其在腦、心臟、法氏囊、脾臟、腎臟、肺臟、肝臟、骨髓組織中分布情況。利用麥芽糖結合蛋白表達系統(tǒng)pMAL-c<,2>X質(zhì)粒表達系統(tǒng)對Gal-2基因進行成功表達，經(jīng)IPTG誘導得到麥芽糖結合蛋白，為下一步純化目的蛋

2、白，研制開發(fā)抗生素替代品提供科學的理論和實踐基礎。 1．雞防御素基因的克隆及組織分布 應用Trizol Reagent試劑盒RNA抽提法，對雞的腦、心臟、法氏囊、脾臟、腎臟、肺臟、肝臟、骨髓進行RNA抽提，經(jīng)2.0％瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)28<,s>和18<,s>RNA兩條清晰的條帶。分光光度計檢測其RNA在260nm和280nm時的OD值，計算雞RNA OD260/OD280值均在1.9左右。實驗所得RNA純度高，滿足實

3、驗要求。 根據(jù)Genbank登錄的Gal-1～Gal-13的基因序列，設計了十三對特異性引物，運用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術，首先反轉(zhuǎn)錄合成雞的13個防御素基因的cDNA第一鏈，然后進行PCR擴增。Gal-1～Gal-12基因的RT-PCR產(chǎn)物均出現(xiàn)特異性條帶。測序結果進行BLAST比對結果顯示：與報導的序列基本一致，同源性均在95％以上，且每個序列都包括完整的開放閱讀框在內(nèi)，為以后利用巢氏PCR進行進一步擴增表達

4、做好了準備。首次在國內(nèi)報導的Gal-4～Gal-12的基因序列。 用十三對特異性引物對從八個組織中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA鏈進行PCR擴增，Gal-1～Gal-12在各個組織中均有分布，骨髓中有Gal-1～7表達，腎臟中有Gal-9～11表達，肝臟中有Gal-1和Gal-8～10表達，腦組織中僅有Gal-5表達，心臟中也只有Gal-12表達，法氏囊中有Gal-1和Gal-3表達，脾臟中只有Gal-1表達，肺臟中有Gal-1～

5、3和Gal-10表達。Gal-13在以上八個組織中未發(fā)現(xiàn)存在，表明可能防御素的分布存在著品種及個體差異，具體原因還有待于進一步的研究。 2．雞Gal-2基因的克隆及鑒定及表達 為了便于對雞Gal-2基因進行表達，在Gal-2的引物P<,1>、P<,2>的5′、3′端設計了EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ酶切位點和相應的保護堿基。首先將雞Gal-2基因的RT-PCR產(chǎn)物純化，插入到克隆載體pGEM-T Easy的多克隆位點中，構建

6、重組質(zhì)粒pGEM-T-Gal-2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，Amp抗性篩選，得到陽性克隆質(zhì)粒。并將該陽性克隆質(zhì)粒進行PCR鑒定，電泳得到約195bp大小的特異性條帶，重組質(zhì)粒構建成功。然后將pMAL-c<,2>X質(zhì)粒進行雙酶切，然后將Gal-2片斷插入到經(jīng)過雙酶切的pMAL質(zhì)粒中，構建了表達載體pMAL-c<,2>X-Gal-2，菌落PCR鑒定挑出陽性轉(zhuǎn)化子，將陽性轉(zhuǎn)化子增菌后用IPTG進行誘導表達，運用SDS-PAGE電泳鑒定融合蛋白已經(jīng)