小鼠孤啡肽基因的克隆及其原核表達(dá).pdf

1、孤啡肽(N/OFQ)作為一種內(nèi)源性阿片肽類受體，屬于G蛋白耦聯(lián)受體，其在中樞和外周組織分布廣泛。該基因在整個腦部區(qū)域有較高表達(dá)，可能在攝食及能量代謝過程中存在相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，而且該基因的神經(jīng)解剖學(xué)定位與能量平衡相關(guān)區(qū)域相一致。為進(jìn)一步研究小鼠N/OFQ基因所編碼蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，本試驗以昆明小鼠為研究對象，根據(jù)NCBI中公布的N/OFQ基因序列，設(shè)計其克隆引物，利用RT-PCR方法克隆小鼠N/OFQ基因，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體pET-2

2、8-N/OFQ，以濃度為1.0mmol/L的IPTG誘導(dǎo)其蛋白表達(dá)，最后通過SDS-PAGE和Western blotting檢測該蛋白。主要結(jié)果如下:
　　1、小鼠N/OFQ基因的克隆及生物信息學(xué)分析從小鼠腦組織抽提總RNA，運用RT-PCR技術(shù)克隆了N/OFQ基因?？寺〉氖驨/OFQ基因包含一個完整的ORF，長度為564bp，編碼187個氨基酸，其中酸性氨基酸39個，堿性氨基酸29個，蛋白質(zhì)分子量為:21.71kDa，等電點為

3、:8.70。通過軟件分析發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列與羊和牛的同源性最高，分別為98.3％和87.5％，與人、褐鼠、獼猴、貂、家兔和豬的同源性分別為83.3％、82.4％、85.2％、85.2％、78.4％和85.8％。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示其與褐鼠的親緣關(guān)系最近，同在一枝上，與其他物種的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。
　　2、小鼠N/OFQ基因的原核表達(dá)為了獲取N/OFQ的蛋白質(zhì)分子，本試驗根據(jù)克隆所得序列設(shè)計合成一對表達(dá)用引物，將小鼠N/OFQ的ORF片

4、段亞克隆至原核表達(dá)載體pET-28 a(+)中，經(jīng)菌液PCR、雙酶切及測序鑒定后，確定成功構(gòu)建了N/OFQ基因的原核表達(dá)載體，將其命名為pET-28-N/OFQ。
　　將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28-N/OFQ轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta中，以終濃度為1.0mmol/L的IPTG，于30℃條件下，誘導(dǎo)6h，誘導(dǎo)產(chǎn)物處理后，通過SDS-PAGE電泳和Western blotting進(jìn)行驗證。利用6×His Ni-NTA純化柱純化所