小鼠CD19胞外區(qū)基因和人組蛋白HleC端基因的克隆及其原核表達(dá).pdf

1、CD19分子是B淋巴細(xì)胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是B淋巴細(xì)胞表面重要標(biāo)志之一。CD19是CD19/CD21/CD81信號(hào)復(fù)合體中一個(gè)成分，信號(hào)復(fù)合體可調(diào)節(jié)BCR刺激活化的閾值，其中CD21(CR2)結(jié)合BCR上的補(bǔ)體C3片段，使CD19與BCR交聯(lián)，促進(jìn)B細(xì)胞激活，這種作用對(duì)于B細(xì)胞初次應(yīng)答尤為重要<'[1～3]>。CD19胞膜外區(qū)參與了與CD21和CD81的相互作用，CD19的跨膜區(qū)也參加了與CD21和CD81的相互作用。CD19胞漿

2、區(qū)可與PI-3K，Vav以及Src家族中Lyn，F(xiàn)yn激酶相結(jié)合<'[4～7]>。 首先根據(jù)GenBank登錄的小鼠CD19基因序列<'[8]>設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)，從小鼠脾臟組織總RNA中擴(kuò)增出一條特異性基因片段，經(jīng)單酶切鑒定，與GenBank中登錄的小鼠CD19基因序列含有相同的單酶切位點(diǎn)。

3、PCR產(chǎn)物分離純化后連接到pGEX-4T-1載體，經(jīng)菌液PCR篩選出陽(yáng)性重組克隆后進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)成功的克隆到CD19基因的胞膜外區(qū)片段，由918個(gè)核苷酸組成，編碼306個(gè)氨基酸。所克隆的小鼠MECD19基因與GenBank中登錄的小鼠CD19基因<'[14]>相比較，有6個(gè)核苷酸的差異，同源性為99.7％。 其次，將原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-MECD19轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21，經(jīng)37℃和1.0mmol/L

4、 IPTG的誘導(dǎo)，SDS-PAGE凝膠電泳表明所克隆的基因片段在大腸桿菌中得到融合表達(dá)，表達(dá)出谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)與MECD19的融合蛋白GST-MECD19，且表達(dá)的產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。所獲得的融合蛋白分子量分別約為59 KD，與預(yù)期結(jié)果相符。 最后，通過(guò)優(yōu)化原核表達(dá)條件，確定了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-MECD19的最佳誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度后，對(duì)含有pGEX-4T-1-MECD19質(zhì)粒的BL21菌

5、進(jìn)行了大量誘導(dǎo)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中使用反復(fù)凍融和超聲方法來(lái)裂解誘導(dǎo)表達(dá)菌，獲得了較高濃度的GST-MECD19包涵體蛋白，用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法使包涵體充分溶解，提取了大量的可溶性GST-MECD19原核融合表達(dá)蛋白。 綜上所述，本研究成功地克隆了小鼠CD19基因的胞外區(qū)片段，并進(jìn)行了原核表達(dá)，獲得了大量的GST-MECD19原核融合表達(dá)蛋白，這些都為進(jìn)一步研究小鼠CD19分子免疫學(xué)功能及其應(yīng)用提供了試驗(yàn)材料。 表達(dá)組

6、蛋白是真核生物染色體(質(zhì))中含量最高的結(jié)構(gòu)蛋白，其總量與染色體DNA大致相等。組蛋白屬于堿性蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)一般在pH10.0以上，能與帶有負(fù)電荷的DNA分子緊密結(jié)合。按組成中精/賴氨酸的比例，組蛋白可被分為五種：H1、H2A、H2B、H3、H4。H1組蛋白由220個(gè)氨基酸組成，分子量較大，進(jìn)化中不如其它組蛋白那么保守，哺乳類細(xì)胞的組蛋白H1約有8種密切相關(guān)的，氨基酸系列上稍有不同的亞型，H1組蛋白在構(gòu)成核小體時(shí)起連接作用，可賦予染色質(zhì)以

7、極性，與核小體包裝成更高一級(jí)結(jié)構(gòu)的過(guò)程相關(guān)<'[1～4]>。 首先根據(jù)GenBank登錄的人組蛋白Histl Hle基因序列<'[5]>設(shè)計(jì)一對(duì)引物，先通過(guò)提取人基因組DNA，再利用PCR技術(shù)，從人基因組DNA中擴(kuò)增出一條特異性基因片段。PCR產(chǎn)物分離純化后連接到pET-32a載體，經(jīng)菌液PCR篩選出陽(yáng)性重組克隆后進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)成功的克隆到人組蛋白Hle基因的C末端區(qū)域，由435個(gè)核苷酸組成，編碼145個(gè)氨基酸。所

8、克隆的人組蛋白Hle C基因與GenBank中登錄的人組蛋白Hle基因相比較，同源性為100％。 其次，將原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-32a-Hle C轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21，經(jīng)37℃和1.0mmol/L IPTG的誘導(dǎo)，SDS-PAGE凝膠電泳表明所克隆的基因片段在大腸桿菌中得到融合表達(dá)，表達(dá)出含有His Tag與人組蛋白Hle基因的融合蛋白His-Hle C，且表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。所獲得的融合蛋白His-Hle C分

9、子量約為36 KD，與預(yù)期結(jié)果相符。 最后，通過(guò)優(yōu)化原核表達(dá)條件，確定了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-32a-Hle C的最佳誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度后，對(duì)含有pET-32a-Hle C質(zhì)粒的BL21菌進(jìn)行了大量誘導(dǎo)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中使用反復(fù)凍融和超聲方法來(lái)裂解誘導(dǎo)表達(dá)菌，獲得了較高濃度的His-HleC包涵體蛋白，用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法使包涵體充分溶解，提取了大量的可溶性His-Hle C原核融合表達(dá)蛋白。 綜上所述，本研究