雞CD4、CD8α基因的克隆和原核表達(dá).pdf

1、CD4和CD8分子是T淋巴細(xì)胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是T淋巴細(xì)胞重要的表面標(biāo)志。CD4和CD8分子作為粘附分子、輔助受體和免疫調(diào)節(jié)物廣泛參與TCR對(duì)MHC分子遞呈抗原的識(shí)別和信號(hào)傳遞。CD4+T細(xì)胞識(shí)別MHCⅡ類分子遞呈的抗原，而CD8+T細(xì)胞識(shí)別MHCⅠ類分子遞呈的抗原。CD4和CD8分子還是一類信號(hào)傳遞受體，兩者分子胞質(zhì)內(nèi)部分與非受體型蛋白酪氨酸激酶Src家族p56lck相連，參與經(jīng)TCR介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。最近的研究結(jié)果表明，C

2、D4分子還是HIV感染人T淋巴細(xì)胞的輔助受體。CD8αα同型二聚體分子在小鼠腸上皮下與非典型MHCⅠ類分子作用，構(gòu)成腸道免疫屏障。雞和哺乳動(dòng)物的CD4和CD8分子在結(jié)構(gòu)和功能上的相似性很明顯，它們與雞的免疫防御緊密相關(guān)，影響機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫。為制備針對(duì)雞CD4和CD8α分子的抗體，初步了解這兩種膜蛋白分子在機(jī)體特異性免疫應(yīng)答中的作用及其機(jī)理，本研究進(jìn)行了雞CD4和CD8α基因的克隆和原核表達(dá)。 首先根據(jù)GenBank登錄

3、的雞CD4和CD8α基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)技術(shù)，從經(jīng)刀豆素A(ConcanavalinA，ConA)誘導(dǎo)活化的雞胸腺淋巴細(xì)胞總RNA中分別擴(kuò)增出兩條特異性基因片段，經(jīng)單酶切鑒定，與GenBank中登錄的雞CD4和CD8α基因序列含有相同的單酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物分離純化后連接到pMD18-T載體，經(jīng)菌液PCR

4、篩選出陽(yáng)性重組克隆后進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)成功的克隆到雞CD4和CD8α基因，兩者分別由1380和651個(gè)核苷酸組成，分別編碼460和217個(gè)氨基酸。所克隆的雞CD4基因與GenBank中登錄的雞CD4基因相比較，都只有1個(gè)核苷酸的差異，導(dǎo)致1個(gè)氨基酸的改變，同源性均為99％。同樣，所克隆的雞CD8α基因與GenBank中登錄的兩條雞CD8α基因相比較，都有12個(gè)核苷酸的差異，分別導(dǎo)致8個(gè)和9個(gè)氨基酸的變化，同源性為98％。

5、 其次，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的雞CD4、CD8α基因序列和原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的多克隆酶切位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，應(yīng)用PCR技術(shù)從重組質(zhì)粒pMD18-T-CD4和pMD18-T-CD8α中擴(kuò)增出編碼雞CD4和CD8α分子膜外IgSF結(jié)構(gòu)域的基因片段，分別編碼雞CD4胞膜外區(qū)遠(yuǎn)端IgSFD1、D2功能結(jié)構(gòu)域和CD8α鏈胞膜外區(qū)的IgSFV功能結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)基因片段長(zhǎng)度分別為579bp和366bp。PCR產(chǎn)物分離純化后連接到原核表達(dá)載體

6、pGEX-4T-1的多克隆酶切位點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)粒PCR和EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定，篩選出陽(yáng)性重組克隆，構(gòu)建成CD4和CD8α基因膜外片斷的原核表達(dá)質(zhì)粒。將這兩種原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-CD4和pGEX-4T-1-CD8α轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)37℃和1.0mmol/LIPTG的誘導(dǎo)，SDS-PAGE凝膠電泳表明所克隆的基因片段在大腸桿菌中得到融合表達(dá)，表達(dá)出谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)與CD4和CD8α的融合蛋白GST-

7、CD4和GST-CD8α，且表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。所獲得的融合蛋白分子量分別約為47KD和39KD，與預(yù)期結(jié)果相符。 最后，通過優(yōu)化原核表達(dá)條件，確定了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-CD8α的最佳誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度，我們用優(yōu)化的原核表達(dá)條件對(duì)含有pGEX-4T-1-CD8α質(zhì)粒的BL21菌進(jìn)行了大量誘導(dǎo)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中使用反復(fù)凍融和超聲方法來(lái)裂解誘導(dǎo)表達(dá)菌，獲得了較高濃度的GST-CD8α包涵體蛋白，用十二烷基肌氨