雞IFN-γ基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、　　干擾素(Interferon，IFN)是一類具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用的細(xì)胞因子。其中，Ⅱ型干擾素(又稱作IFN-γ)是在抗原或有絲分裂原的刺激下，主要由活化的T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞所產(chǎn)生，它影響機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。為了了解雞IFN-γ在抗病毒免疫應(yīng)答中的作用及其機(jī)理，本研究進(jìn)行了該基因的克隆、表達(dá)和鑒定?！　∈紫?，根據(jù)GenBank已登錄的雞IFN-γ序列，應(yīng)用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，應(yīng)用反轉(zhuǎn)

2、錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)，從經(jīng)刀豆素A(ConA)誘導(dǎo)活化的雞脾淋巴細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增得到一條特異性基因片段，其大小約為500bp。PCR產(chǎn)物分離純化后將其克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1上，經(jīng)質(zhì)粒PCR和EcoRI、SalI雙酶切鑒定，篩選出陽(yáng)性重組克隆后進(jìn)行序列測(cè)定?！　∑浯?，對(duì)該序列及多種動(dòng)物的IFN-γ運(yùn)用計(jì)算機(jī)序列分析軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列的比較分析和遺傳進(jìn)化分析。基因進(jìn)化樹(shù)和氨基酸進(jìn)化樹(shù)分析表明：本研

3、究所克隆的ChIFN-γ序列，無(wú)論從核苷酸水平還是氨基酸水平，與雞形目和哺乳類動(dòng)物的IFN-γ序列的進(jìn)化關(guān)系均比雞Ⅰ型干擾素近，同時(shí)經(jīng)抗原性比較分析，雞形目下IFN-γ的抗原性有較高的相似性?！　∽詈?，將重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-IFN-γ轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌，經(jīng)37℃和1.0mmol/LIPTG的誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE凝膠電泳表明該基因在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。融合蛋白的分子量約為43k