雞IFN-γ基因的克隆與原核表達(dá).pdf_第1頁(yè)
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1、  干擾素(Interferon,IFN)是一類具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用的細(xì)胞因子。其中,Ⅱ型干擾素(又稱作IFN-γ)是在抗原或有絲分裂原的刺激下,主要由活化的T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞所產(chǎn)生,它影響機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。為了了解雞IFN-γ在抗病毒免疫應(yīng)答中的作用及其機(jī)理,本研究進(jìn)行了該基因的克隆、表達(dá)和鑒定?! ∈紫?,根據(jù)GenBank已登錄的雞IFN-γ序列,應(yīng)用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,應(yīng)用反轉(zhuǎn)

2、錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù),從經(jīng)刀豆素A(ConA)誘導(dǎo)活化的雞脾淋巴細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增得到一條特異性基因片段,其大小約為500bp。PCR產(chǎn)物分離純化后將其克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1上,經(jīng)質(zhì)粒PCR和EcoRI、SalI雙酶切鑒定,篩選出陽(yáng)性重組克隆后進(jìn)行序列測(cè)定?! ∑浯?,對(duì)該序列及多種動(dòng)物的IFN-γ運(yùn)用計(jì)算機(jī)序列分析軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列的比較分析和遺傳進(jìn)化分析。基因進(jìn)化樹(shù)和氨基酸進(jìn)化樹(shù)分析表明:本研

3、究所克隆的ChIFN-γ序列,無(wú)論從核苷酸水平還是氨基酸水平,與雞形目和哺乳類動(dòng)物的IFN-γ序列的進(jìn)化關(guān)系均比雞Ⅰ型干擾素近,同時(shí)經(jīng)抗原性比較分析,雞形目下IFN-γ的抗原性有較高的相似性?! ∽詈?,將重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-IFN-γ轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌,經(jīng)37℃和1.0mmol/LIPTG的誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE凝膠電泳表明該基因在大腸桿菌中得到高效表達(dá),且表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。融合蛋白的分子量約為43k

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