獼猴IFN-γ基因的克隆表達(dá)及其檢測方法的建立.pdf

1、結(jié)核病是一種人獸共患的慢性消耗性傳染病，是目前致死亡人數(shù)最多的傳染病，由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTC)成員引起。獼猴(Macaca mulatta，Mm)為我國Ⅱ級重點(diǎn)保護(hù)野生動物，也是醫(yī)學(xué)研究中具有很高價值的實(shí)驗(yàn)動物，在我國分布廣泛。非人靈長類是結(jié)核病的敏感物種，其中獼猴最為易感。猴群發(fā)生結(jié)核病，會導(dǎo)致猴群的損失，同時實(shí)驗(yàn)猴發(fā)生結(jié)核分枝桿菌感染會對實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目產(chǎn)生嚴(yán)重干擾

2、，并可能傳染人。目前，尚無有效疫苗預(yù)防獼猴結(jié)核病，控制獼猴結(jié)核病的主要措施是“檢疫一撲殺”。因此，一種敏感性和特異性俱佳的獼猴結(jié)核病檢測方法是實(shí)施該措施的前提條件。
　　 結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(tuberculin skin test，TST)是目前最常用的結(jié)核病檢測方法。此方法操作繁瑣，主觀性強(qiáng)，假陽性率高。干擾素是一種具有多種生物活性的低分子量糖蛋白，結(jié)核分枝桿菌感染能刺激體內(nèi)免疫細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。利用這一原理建立的結(jié)核病IF

3、N-γ體外釋放檢測法在發(fā)達(dá)國家已被廣泛用于牛結(jié)核和人結(jié)核的感染檢測。國外也有猴結(jié)核IFN-γ檢測試劑盒。但這些產(chǎn)品均價格高，且貨源難得。本研究旨在自主建立獼猴結(jié)核IFN-γ檢測法，為我國獼猴結(jié)核的診斷與防控提供技術(shù)手段。主要研究內(nèi)容包括：克隆獼猴IFN-γ(MmIFN-γ)基因，進(jìn)行了原核和真核表達(dá)，進(jìn)一步純化了IFN-γ重組蛋白，制備和篩選了抗MmIFN-γ的單克隆抗體；制備了抗MmIFN-γ的多克隆抗體。在此基礎(chǔ)上建立了檢測MmIF

4、N-γ的間接夾心ELISA方法，通過臨床樣本檢測驗(yàn)證了該方法的可行性。
　　 1.獼猴IFN-γ的克隆與原核和酵母表達(dá)
　　 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室保存的獼猴IFN-γ cDNA設(shè)計一對引物并進(jìn)行擴(kuò)增，將MmIFN-基因克隆至原核表達(dá)載體pET-30a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，結(jié)果成功表達(dá)出大小為24 kDa左右的His-tag-MmIFN-γ重組融合蛋白。
　　 同時，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室保存的獼猴IFN-γ cD

5、NA設(shè)計另一對引物并進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)一步將MmIFN-γ基因克隆至酵母表達(dá)載體pPICZaA，電轉(zhuǎn)化酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，結(jié)果表達(dá)出17 kDa的MmIFN-γ和約22 kDa的糖基化重組MmIFN-γ蛋白。
　　 2.獼猴IFN-γ單克隆抗體、多克隆抗體的制備以及鑒定
　　 利用原核表達(dá)的MmIFN-γ免疫Balb/C小鼠，用原核表達(dá)的MmIFN-γ建立間接ELISA篩選雜交瘤細(xì)胞株，獲得10株單克隆抗體，

6、分別命名為2A1、2C3、2F6、2H8、3A1、382、3E5、3F6、3G7、3H9。單抗腹水效價在3.2×103(3G7)-6.5×106(2A1)之間，單抗相對親和力在104-107之間。間接ELISA表明10株單抗都能和酵母表達(dá)MmIFN-γ進(jìn)行反應(yīng)。
　　 利用原核表達(dá)的MmIFN-γ免疫日本大耳白兔，獲得高免血清，經(jīng)純化獲得兔抗MmIFN-γ多克隆抗體，ELISA抗體效價為5.12×104。
　　 3.間接

7、雙夾心ELISA方法的建立和應(yīng)用
　　 用2F6株單抗、多抗及HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，建立檢測MmIFN-γ的雙夾心ELISA方法。此ELISA方法檢測原核表達(dá)的MmIFN-γ靈敏度達(dá)到125pg/mL，同時能檢測獼猴天然IFN-γ。用該方法檢測了7份結(jié)核菌素皮試陰性猴的外周血細(xì)胞經(jīng)牛PPD刺激后的培養(yǎng)液，結(jié)果全為陰性。檢測陰性猴外周血細(xì)胞ConA刺激后的培養(yǎng)液，結(jié)果為陽性。檢測靈敏度為125pg/mL時，其對應(yīng)OD630值為