牛IFN-α-γ基因的克隆、表達及重組蛋白的應用研究.pdf

1、該研究通過PCR克隆了中國地方品種晉南黃牛、荷斯坦奶牛、福安水牛、富鐘水牛、環(huán)湖型牦牛以及野牦牛的IFN-α基因,構建了原核表達質(zhì)粒pQE30/BoIFN-α.測序結(jié)果表明,六個克隆片段全長均為498個核苷酸,編碼166個氨基酸的成熟蛋白,與文獻報道的BoIFN-α各亞型相比,只有荷斯坦奶牛IFN-α基因與BoIFN-αA亞型存在一個點變異,其余五個克隆均為BoIFN-α新亞型,建議命名為BoIFN-αD<,2>、BoIFN-αI、Bo

2、IFN-αJ、BoIFN-αK和BoIFN-αL.pQE30/BoIFN-α在大腸桿菌JM109中表達出了一條分子量20kD的特異蛋白帶,表達蛋白以包涵體形式存在,表達量占菌體總蛋白的25﹪.粗制rBoIFN-α在CEF/VSV和MDBK/VSV細胞系上的抗病毒活性分別為×10<'5>U/mg和×10<'6>U/mg,在MDBK細胞上對IBRV攻擊有一定的抵抗力.這一結(jié)果表明BoIFN-α基因序列的變化并沒有引起蛋白生物學活性改變,可能

3、只與品種進化和地理分布有關.從經(jīng)Con A刺激的荷斯坦奶牛外周血淋巴細胞中提取總RNA,通過RT-PCR克隆了BoFN-γ cDNA全基因,與克隆載體T-Easy連接.測序結(jié)果表明,BoFN-γ cDNA全長501個核苷酸,編碼166個氨基酸的前體蛋白,與GenBank中BoFN-γ序列存在不同程度的點變異.亞克隆BoFN-γ成熟肽基因,分別構建原核表達菌株pET28a/BoIFN-γ/BL21(DE3)和畢赤酵母表達菌株pPICZa/

4、BoIFN-γ/GS115.原核表達菌株在30℃和37℃均表達出18kD目的蛋白,37℃表達量占菌體總蛋白的37﹪,表達蛋白以包涵體形式存在;30℃表達量占菌體總蛋白的18﹪,但25﹪的表達蛋白以可溶形式存在于裂解上清中.BoFN-γ在酵母中實現(xiàn)了高效分泌表達,表達產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)上清中,表達量高可1.0g/L.抗病毒活性試驗表明,rBoIFN-γ(P.pastoris)在CEF/VSV和MDBK/VSV細胞系上抗病毒活性分別達×10

5、<'5>U/mg和×10<'6>U/mg,而rBoIFN-γ(E.coli)的抗病毒活性分別達×10<'4>U/mg和×10<'5>U/mg,統(tǒng)計學分析差異顯著.從PMD-18/VPI中亞克隆了FMDV抗原基因VPI,分別將VP1及VP1與BoIFN-γ在畢赤酵母中進行了表達與共表達.表達的VP1蛋白分子量為28kD,共表達蛋白BoIFN-γ/VP1分子量為52kD,表達產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)上清中,表達量高達1.0g/L.將畢赤酵母表達的

6、 rVP1、rBoIFN-γ和共表達rBoIFN-γ/VP1蛋白分別免疫小鼠,分別于每次免疫后2周采血、分離血清,ELISA測定血清抗體效價;末次免疫后2周分離脾臟淋巴細胞,用MTT法做T淋巴細胞增殖試驗;通過半定量RT-PCR檢測細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10表達水平,試驗結(jié)束前三天做遲發(fā)型超敏反應.小鼠免疫試驗結(jié)果表明,畢赤酵母表達的VP1蛋白具有良好的免疫原性,可以刺激免疫小鼠產(chǎn)生明顯的體液免疫和細胞免疫反應;