牛IFN-α-γ基因的克隆、表達(dá)及重組蛋白的應(yīng)用研究.pdf

1、該研究通過(guò)PCR克隆了中國(guó)地方品種晉南黃牛、荷斯坦奶牛、福安水牛、富鐘水牛、環(huán)湖型牦牛以及野牦牛的IFN-α基因,構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pQE30/BoIFN-α.測(cè)序結(jié)果表明,六個(gè)克隆片段全長(zhǎng)均為498個(gè)核苷酸,編碼166個(gè)氨基酸的成熟蛋白,與文獻(xiàn)報(bào)道的BoIFN-α各亞型相比,只有荷斯坦奶牛IFN-α基因與BoIFN-αA亞型存在一個(gè)點(diǎn)變異,其余五個(gè)克隆均為BoIFN-α新亞型,建議命名為BoIFN-αD<,2>、BoIFN-αI、Bo

2、IFN-αJ、BoIFN-αK和BoIFN-αL.pQE30/BoIFN-α在大腸桿菌JM109中表達(dá)出了一條分子量20kD的特異蛋白帶,表達(dá)蛋白以包涵體形式存在,表達(dá)量占菌體總蛋白的25﹪.粗制rBoIFN-α在CEF/VSV和MDBK/VSV細(xì)胞系上的抗病毒活性分別為×10<'5>U/mg和×10<'6>U/mg,在MDBK細(xì)胞上對(duì)IBRV攻擊有一定的抵抗力.這一結(jié)果表明BoIFN-α基因序列的變化并沒(méi)有引起蛋白生物學(xué)活性改變,可能

3、只與品種進(jìn)化和地理分布有關(guān).從經(jīng)Con A刺激的荷斯坦奶牛外周血淋巴細(xì)胞中提取總RNA,通過(guò)RT-PCR克隆了BoFN-γ cDNA全基因,與克隆載體T-Easy連接.測(cè)序結(jié)果表明,BoFN-γ cDNA全長(zhǎng)501個(gè)核苷酸,編碼166個(gè)氨基酸的前體蛋白,與GenBank中BoFN-γ序列存在不同程度的點(diǎn)變異.亞克隆BoFN-γ成熟肽基因,分別構(gòu)建原核表達(dá)菌株pET28a/BoIFN-γ/BL21(DE3)和畢赤酵母表達(dá)菌株pPICZa/

4、BoIFN-γ/GS115.原核表達(dá)菌株在30℃和37℃均表達(dá)出18kD目的蛋白,37℃表達(dá)量占菌體總蛋白的37﹪,表達(dá)蛋白以包涵體形式存在;30℃表達(dá)量占菌體總蛋白的18﹪,但25﹪的表達(dá)蛋白以可溶形式存在于裂解上清中.BoFN-γ在酵母中實(shí)現(xiàn)了高效分泌表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)上清中,表達(dá)量高可1.0g/L.抗病毒活性試驗(yàn)表明,rBoIFN-γ(P.pastoris)在CEF/VSV和MDBK/VSV細(xì)胞系上抗病毒活性分別達(dá)×10

5、<'5>U/mg和×10<'6>U/mg,而rBoIFN-γ(E.coli)的抗病毒活性分別達(dá)×10<'4>U/mg和×10<'5>U/mg,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異顯著.從PMD-18/VPI中亞克隆了FMDV抗原基因VPI,分別將VP1及VP1與BoIFN-γ在畢赤酵母中進(jìn)行了表達(dá)與共表達(dá).表達(dá)的VP1蛋白分子量為28kD,共表達(dá)蛋白BoIFN-γ/VP1分子量為52kD,表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)上清中,表達(dá)量高達(dá)1.0g/L.將畢赤酵母表達(dá)的

6、 rVP1、rBoIFN-γ和共表達(dá)rBoIFN-γ/VP1蛋白分別免疫小鼠,分別于每次免疫后2周采血、分離血清,ELISA測(cè)定血清抗體效價(jià);末次免疫后2周分離脾臟淋巴細(xì)胞,用MTT法做T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn);通過(guò)半定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10表達(dá)水平,試驗(yàn)結(jié)束前三天做遲發(fā)型超敏反應(yīng).小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果表明,畢赤酵母表達(dá)的VP1蛋白具有良好的免疫原性,可以刺激免疫小鼠產(chǎn)生明顯的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng);