斑點熱立克次體ompA和ompB基因片段的克隆與表達及重組蛋白抗原性的研究.pdf

1、斑點熱(spottedfever)是由斑點熱群立克次體(spottedfevergrouprickettsia，SFGR)所引起的一組疾病的總稱。190kDa(外膜蛋白A，OmpA)和120kDa(外膜蛋白B，OmpB)是斑點熱立克次體最主要的表面蛋白抗原，被認為是發(fā)展斑點熱的診斷試劑和亞單位疫苗的靶分子。本研究旨在克隆與表達斑點熱立克次體的ompA和ompB部分基因片段，并對所表達的重組蛋白的抗原性進行研究。采用PCR方法，從斑點熱立

2、克次體的基因組中擴增到ompA和ompB基因的基因片段，將兩個基因片段分別與原核表達載體pQE30連接，構建重組質粒pQE30/ompA和pQE30/ompB。將該重組質粒分別轉化大腸桿菌，并用IPTG誘導轉化菌表達目的蛋白。SDS-PAGE鑒定pQE30/ompA和pQE30/ompB轉化菌分別表達了56kDaOmpA和44kDaOmpB重組蛋白。 免疫印跡分析證明立氏立克次體的OmpB重組蛋白僅與立氏立克次體全菌免疫血清發(fā)生

3、特異反應。用純化的OmpB重組蛋白免疫家兔，間接免疫熒光試驗(IFA)該重組蛋白能有效地誘導家兔產(chǎn)生高水平的特異性IgG。IFA分析發(fā)現(xiàn)該重組蛋白免疫血清與立氏立克次體全菌抗原發(fā)生特異性反應，而與其它立克次體的全菌抗原無明顯交叉反應。這些結果說明本次研究制備的OmpB重組蛋白為立氏立克次體種特異性抗原，該重組蛋白免疫血清可以用作檢測立氏立克次體的特異性抗體。 血清學分析顯示黑龍江立克次體56kDaOmpA重組蛋白能與黑龍江立克次

4、體、立氏立克次體、斑點熱群立克次體精河株等斑點熱立克次體免疫血清發(fā)生交叉反應，提示該OmpA重組蛋白具有斑點熱群特異性。用OmpA重組蛋白免疫小鼠和豚鼠，采用IFA檢測免疫動物的血清特異性抗體水平，結果顯示該OmpA重組蛋白能有效地誘導動物產(chǎn)生較高水平的特異性IgG。為了了解OmpA重組蛋白誘導細胞免疫應答的能力，我們采用MTT法分析OmpA免疫小鼠脾細胞在該抗原刺激下的增殖水平。結果顯示免疫小鼠脾細胞在OmpA的刺激下的細胞增殖水平顯

5、著高于對照，提示OmpA具有T細胞表位，能夠有效刺激機體產(chǎn)生特異性細胞免疫應答。 用黑龍江立克次體和立氏立克次體分別攻擊黑龍江立克次體OmpA重組蛋白免疫豚鼠，結果發(fā)現(xiàn)免疫動物受立克次體攻擊后的發(fā)熱和臟器的病理學改變顯著輕于非免疫組，說明OmpA重組蛋白免疫既能有效抗擊同源立克次體的攻擊，也能抵抗異種斑點熱立克次體的感染。本次研究結果顯示OmpA重組蛋白具有良好的免疫原性，能夠有效地誘導機體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細胞免疫應答，并