普氏立克次體120kDa表面蛋白基因的克隆與表達(dá)及重組蛋白抗原性的研究.pdf

1、普氏立克次體(Rickettsia prowazekii,R.P)是專性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌,流行性斑疹傷寒的病原體.普氏立克次體種特異性的120kDa表面蛋白是發(fā)揮主要免疫作用的表面抗原,是發(fā)展流行性斑疹傷寒的診斷制劑和亞單位疫苗的合適靶蛋白.該研究是在克隆與表達(dá)普氏立克次體的120kDa表面蛋白抗原特異性較好的N端部分和免疫反應(yīng)性較好的C端部分的基因片段,并對表達(dá)的重組蛋白的抗原性進(jìn)行研究.采用PCR方法,從普氏立克次體基因組中

2、擴(kuò)增到120kDa表達(dá)蛋白抗原N端基因片段和C端基因片段,將兩個基因片段分別與原核表達(dá)載體pQE30連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30/N和pQE30/C.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,并用IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌表達(dá)目的蛋白.SDS-PAGE鑒定pQE30/N轉(zhuǎn)化菌表達(dá)的N端重組蛋白的分子量為26kDa,pQE30/C轉(zhuǎn)化菌表達(dá)的C端重組蛋白的分子量為67kDa.免疫印跡分析證明N端重組蛋白和C端重組蛋白均能與普氏立克次體免疫血清特異反應(yīng),N端

3、重組蛋白僅與立氏立克次體免疫血清發(fā)生交叉反應(yīng),C端重組蛋白則與立克次體屬的多種立克次體免疫血清發(fā)生交叉反應(yīng).用ELISA分析重組蛋白與各種相關(guān)免疫血清的交叉反應(yīng),發(fā)現(xiàn)N端重組蛋白和C端重組蛋白與立克次體屬內(nèi)的立克次體免疫血清有較強(qiáng)的交叉反應(yīng),但是與貝氏柯克斯體、恙蟲病東方體以及其它相關(guān)病原體免疫血清無交叉反應(yīng),提示N端重組蛋白和C端重組蛋白具有立克次體屬特異性.用N端重組蛋白免疫血清和C端重組蛋白免疫血清與各種相關(guān)病原菌抗原作間接免疫熒

4、光分析.為了證明重組蛋白的免疫原性,用純化的N端重組蛋白和C端重組蛋白免疫小鼠和家兔.采用間接免疫熒光和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測免疫小鼠和家兔的血清特異性抗體水平.兩個重組蛋白分別對同源蛋白免疫小鼠和普氏立克次體全細(xì)胞抗原免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外刺激,均能誘導(dǎo)較高水平的淋巴細(xì)胞增殖.足墊腫脹實(shí)驗(yàn)提示C端重組蛋白能夠誘導(dǎo)小鼠發(fā)生明顯的特異性遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng).采用RT-PCR方法,分析普氏立克次體全細(xì)胞抗原免疫小鼠的脾臟T淋巴細(xì)胞被不同抗原刺