幽門螺桿菌CagA和VacA重組蛋白的表達、純化及抗原性檢測.pdf

1、目的:構建幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)細胞毒素相關基因A(Cytotoxin associated gene A,CagA)和空泡細胞毒素(Vacuolating cytotoxin A,VacA)的重組質粒,并在大腸桿菌中表達獲得基因重組蛋白,為檢出幽門螺桿菌致病株和運用于臨床檢測Hp的感染奠定基礎。
　　 方法:挑選CagA基因和VacA基因的優(yōu)勢抗原表位片段,收集H.pylori標準株NCTC

2、11639,提取基因組DNA,PCR擴增目的基因片斷,將其分別克隆到克隆載體pGEM-T和pMD18-T載體并測序,構建重組質粒pGEM-T／CagA和pMD18-T／VacA,將鑒定正確的重組質粒進行雙酶切,把目的基因克隆入表達載體pET-16b,構建重組表達載體pET16b／CagA與pET16b／VacA。轉化至大腸桿菌E Coli Rosetta后誘導表達,經(jīng)SDS-PAGE鑒定、鎳親和層析純化,并透析復性后,ELISA法檢測重

3、組蛋白CagA、VacA的免疫原性。
　　 結果:PCR擴增結果表明分別得到了大小約為1962bp和2256bp的目的片段:構建的重組質粒經(jīng)酶切鑒定和測序證明其中插入片段分別為CagA和VacA的目的基因,測序結果與Genbank上登錄序列比對后,結果完全一致:SDS-PAGE分析顯示,在IPTG誘導下,重組工程菌表達了一相對分子量(Mr)約為75KDa和87KDa的目的蛋白條帶,表達量占細菌總蛋白的20％,鎳親和層析純化率約9

4、0％；目的蛋白在菌體細胞內主要以可溶性蛋白和包涵體形式存在,經(jīng)間接ELISA法檢測重組蛋白CagA、VacA具有一定免疫原性。
　　 結論:成功構建了pET16b／CagA、pET16b／VacA2個原核表達重組體,將其分別轉化至大腸桿菌后,分別表達出了相對分子量(Mr)約為75KDa租87KDa的CagA和VacA重組蛋白,間接ELISA法檢測重組蛋白CagA、VacA具有較好的免疫反應性,其中CagA蛋白的免疫反應性較Vac