幽門螺桿菌CagA、VacA及外膜蛋白HomA、HomB多態(tài)性與疾病的關(guān)系.pdf

1、研究背景與目的:
　　幽門螺桿菌(H.pylori)感染的結(jié)局是多樣性的,可以是無癥狀細(xì)菌攜帶,也可以引起慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤。H.pylori感染后的結(jié)局主要受細(xì)菌、宿主和環(huán)境因素三者的影響,其中細(xì)菌因素起重要作用,而H.pylori致病因子基因多態(tài)性是其重要原因。H.pylori的細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白基因(cagA)及空泡毒素相關(guān)基因(vacA)是H.pylori兩個(gè)最重要的致病毒力因

2、子,近年研究發(fā)現(xiàn)H.pylori的外膜蛋白homB在其致病中也起重要作用。在我國(guó)大部分H.pylori菌株都帶有vacA和cagA基因,因此無法單純地用它們的表達(dá)來確定其毒力作用及其和疾病的相關(guān)性。近年研究表明vacA基因信號(hào)區(qū)、開碼讀框的中間區(qū)和基因的中間區(qū)域的基因多態(tài)性,以及CagA EPIYA基序的多態(tài)性與疾病的轉(zhuǎn)歸有關(guān)。國(guó)外學(xué)者研究表明HomA和HomB參與了H.pylori的致病,但所得結(jié)果不一致,這可能與它們的基因多態(tài)性和地

3、域差異有關(guān)。本文觀察了來自不同疾病的170株臨床分離的H. pylori菌株的cagA、vacA、homA和homB基因的表達(dá),并同時(shí)進(jìn)行了vacA分型,CagA的EPIYA基序分型和homB基因的全長(zhǎng)測(cè)序,以期分析這三個(gè)基因及它們的基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系。
　　方法:
　　1.H.pylori外膜蛋白HomA及HomB的基因檢測(cè):
　　(1)對(duì)前期分離的170株臨床H.pylori菌株進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng),并提取其基因組DN

4、A;
　　(2)對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行稀釋,以備后用;
　　(3)對(duì)homA和homB基因中間區(qū)域的差異片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì),從而可以檢測(cè)出表達(dá)homA和homB的菌株;
　　(4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)homB161bp,homA128bp的兩個(gè)條帶,分別得到表達(dá)homA和homB的菌株。
　　2. H.pylori外膜蛋白HomB基因序列特征及CagA(EPIYA)、VacA(s/i/m)基因分

5、析
　　(1)針對(duì)H.pylori外膜蛋白HomB、CagA(EPIYA)及VacA(s/i/m)基因序列合成多對(duì)特異性測(cè)序引物;
　　(2)對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,并將其產(chǎn)物送華大基因公司測(cè)序;
　　(3)得到homB和CagA(EPIYA)的測(cè)序結(jié)果,以及VacA(s/i/m)分型結(jié)果,利用生物信息學(xué)軟件—Primer5.0、MEGA、AlignX,及相關(guān)信息數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行DNA序列和氨基酸序列比對(duì),分析外膜蛋白HomB以

6、及兩種毒力基因的多態(tài)性與臨床疾病、病理之間的聯(lián)系。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行處理,應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.CagA羧基端可變區(qū)(EPIYA)氨基酸序列的特征分析:
　　在來自臨床分離的H.pylori170株中,100％表達(dá)cagA基因。通過測(cè)序得到cagA3′端可變區(qū)序列全長(zhǎng),其DNA序列翻譯為氨

7、基酸后CagA的C端可變區(qū)起始于5個(gè)或6個(gè)多聚天門冬氨酸NNNNNN,終止于LSKVG序列。其EPIYA基序數(shù)量為0~4個(gè):4株含有4個(gè)EPIYA基序,其中兩株為胃癌株;2株含有2個(gè)EPIYA基序的均為慢性胃炎株;3株EPIYA基序缺失的突變株;161株3個(gè)EPIYA基序的菌株無明顯的疾病相關(guān)性。所有 H.pylori菌株可分為三種序列型—即含有2個(gè)EPIYA基序的AB型、含有3個(gè)EPIYA基序的ABD型和含有4個(gè)EPIYA基序的AAB

8、D型,均為東方型(TIDD)。
　　進(jìn)一步分析EPIYA基序中的多態(tài)性發(fā)現(xiàn):2株EPIYA-A突變的H.pylori均來自慢性胃炎患者,而9株EPIYA-B突變的H.pylori菌中的2株來自胃癌患者,7株來自十二指腸潰瘍患者,表明EPIYA-B突變株致病性更強(qiáng)。
　　2. vacA基因分型:
　　對(duì)170株H.pylori vacA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,除第152株菌i1、i2不表達(dá)外,其余菌株均為s1a/m2/i1型

9、,與疾病無相關(guān)性。由于vacA基因分型是:s1型有毒力、s2型沒有毒力,同樣的m1型的毒力強(qiáng)于m2型,i1型有毒力而i2型弱或無毒力。提示江西地區(qū)的菌株,其vacA的基因型較為保守,表達(dá)集中,且大部分均為中等強(qiáng)度毒力菌株,它們導(dǎo)致不同的疾病可能是多個(gè)毒力因子共同作用所致。
　　3.H.pylori外膜蛋白HomA和HomB基因的表達(dá):
　　(1) homA和homB在臨床疾病中的分布
　?、僭趤碜耘R床分離的H.pylo

10、ri170株中,其中27株來自胃癌、20株來自胃潰瘍、75株來自十二指腸潰瘍、48來自株胃炎;
　?、趆omA單陽性率為14.7%(25/170),其在胃癌、胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃炎的陽性率分別為22.2%(6/27)、20.0%(4/20)、13.3%(10/75)、10.4%(5/48),各組間無顯著差異(p>0.05);
　　③homB單陽性率為70%(119/170),其在胃癌、胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃炎的陽性率分

11、別為74.1%(20/27)、75.0%(15/20)、68.0%(51/75)、68.8%(33/48),各組間無顯著差異(p>0.05);
　?、躧omA和homB雙陽性率為15.3%(26/170),其在胃癌、胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃炎的陽性率分別為3.7%(1/27)、5.0%(1/20)、18.7%(14/75)、20.8%(10/48),其中胃癌組與胃炎組中表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.044),其余各組間無顯著差異。

12、r>　　(2)homA和homB在臨床病理中的分布
　?、僭趤碜耘R床分離的H.pylori170株中,其中90株(十二指腸潰瘍者及5株慢性胃炎患者未進(jìn)行病理學(xué)檢查)有臨床病理檢測(cè)結(jié)果、42株為慢性淺表性胃炎、21株為腸上皮化生(腸化)和不典型增生、27株為胃癌;
　?、趆omA單陽性率為14.4%(13/90),其在慢性淺表性胃炎、腸化和不典型增生、胃癌的陽性率分別為9.5%(4/42)、4.3%(3/21)、22.2%(6

13、/27),各組間(p>0.05)無顯著差異;
　?、踙omB單陽性率為68.9%(62/90),其在慢性淺表性胃炎、腸化和不典型增生、胃癌的陽性率分別為64.3%(27/42)、71.4%(15/21)、74.1%(20/27),各組間(p>0.05)無顯著差異;
　?、躧omA和 homB雙陽性率為16.7%(15/90),其在慢性淺表性胃炎、腸化和不典型增生、胃癌中的陽性率分別為26.2%(11/42)、14.3%(3/

14、21)、3.7%(1/27),homA和homB雙陽性在三種病理中表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.047),同時(shí)在胃癌組與慢性淺表性胃炎組中表達(dá)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.016),其余各組間無顯著差異。
　　4.homB基因測(cè)序與比對(duì)分析
　　homB基因陽性的145株中,經(jīng)過3次優(yōu)化條件的PCR和測(cè)序,最終僅獲得了59株菌的完整全長(zhǎng)序列。其中胃癌株的測(cè)序成功率(9.5%)顯著低于其它3組(50.0%~66.7%)(p<0.05)。

15、基因測(cè)序失敗的原因目前認(rèn)為主要是因?yàn)榛蛐蛄斜旧淼母呒?jí)結(jié)構(gòu)、重復(fù)序列以及高GC含量等,導(dǎo)致測(cè)序時(shí)出現(xiàn)結(jié)合、雜合等所致,而胃癌株測(cè)序成功率低,提示其高級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜或重復(fù)序列多,這可能是胃癌株毒力較強(qiáng)的原因之一。
　　將這些序列利用MEGA和AlignX等生物信息學(xué)軟件逐個(gè)進(jìn)行校對(duì)后再與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)homB整個(gè)基因序列的變化很大,且100~1600位點(diǎn)上基因多態(tài)性較強(qiáng),后半部分變化比較小,但整個(gè)序列的保守性較差。這59株H.

16、pylori的homB基因序列無明顯的疾病聚集性,這可能是因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)復(fù)雜和多態(tài)性強(qiáng)的菌株未能成功測(cè)序所致。
　　將江西地區(qū)的homB基因與國(guó)外的14株標(biāo)準(zhǔn)菌株的homB基因輸入MEGA軟件進(jìn)行比對(duì)和聚類分析,發(fā)現(xiàn)突變廣泛存在于不同區(qū)域的菌株中;東西方國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌株之間存在較大差異性;江西地區(qū)菌株與東亞國(guó)家(日本,韓國(guó))標(biāo)準(zhǔn)菌株之間也存在較大差異性。同時(shí)江西地區(qū)的菌株以及日本和韓國(guó)國(guó)內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)菌株均無明顯的地區(qū)聚集性,并且西方國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)菌

17、株分布更為離散。
　　結(jié)論:
　　1.江西地區(qū)cagA基因的陽性率為100%,明顯高于其他地區(qū),且cagA基因均為東亞型。
　　2.H.pylori的致病性會(huì)隨著CagA EPIYA基序數(shù)量的增加而增強(qiáng),EPIYA-B突變的致病性強(qiáng)于EPIYA-A突變株和無突變株。
　　3.江西地區(qū)的vacA基因,除一株菌i型無表達(dá)外,其余均為s1a/m2/i1型,且不同疾病中其毒力也無明顯差異。
　　4.江西地區(qū)的H.p